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1概述

動物受到病毒感染后,體內產生特異性中和抗體,並與相應的病毒粒子呈現特異性結合,因而阻止病毒對敏感細胞的吸附,或抑制其侵入,使病毒失去感染能力。
中和試驗 (Neutralization Test)是以測定病毒的感染力為基礎,以比較病毒受免疫血清中和后的殘存感染力為依據,來判定免疫血清中和病毒的能力。

2兩種試驗方法介紹

中和試驗常用的有兩種方法:一種是固定病毒量與等量系列倍比稀釋的血清混合,另一種是固定血清用量與等量系列對數稀釋(即十倍遞次稀釋)的病毒混合。
固定病毒-稀釋血清法
(血清中和試驗)
1.病毒毒價的測定(微量法)
(1) 病毒的製備 將病毒接種於單層細胞,37℃吸附1h后加入維持液,置溫箱培養;逐日觀察,待細胞病變(CPE)達75%以上,收穫病毒懸液凍融或超聲波處理,以3 000r/min離心10min,取上清液,定量分裝成1ml小瓶置-70℃保存備用,選用的病毒必須是對細胞有較穩定的致病力。
(2) 病毒毒價測定 取置-70℃冰箱保存的病毒一瓶,將病毒在96孔培養板上作10倍遞進稀釋即10,10,10……,每孔病毒懸液量為50μl,每個稀釋度作8孔,每孔加入100細胞懸液,每塊板的最後一行設8孔細胞對照,製備細胞懸液的濃度以使細胞在24h內長滿單層為度。把培養板置5%CO2溫箱37℃培養,從48-14h逐日觀察細胞病變,記錄結果。
按Reed和Muench兩氏法計算TCID50。
56%-50%
距離比例= ────────
56%-33%
本例高於50%病毒稀釋度的對數為-6,距離比例為0.26,稀釋係數的對數為-1。
表2-25 TCID50計算(接種劑量50μl)
病毒稀釋度
接種數
CPE數
無CPE數
累 計
CPE率
百分數(%)
CPE
無CPE
10
8
8
0
39
0
39/39
100
10
8
8
0
31
0
31/31
100
10
8
7
1
23
1
23/24
96
10
8
5
3
15
4
15/19
79
10
8
4
4
10
8
10/18
56
10
8
4
4
6
12
6/18
33
10
8
2
6
2
18
2/20
10
10
8
0
8
0
26
0/26
0
IgTCID50= -6+0.26×(-1)
= -6.3
則TCID50=10,50即病毒作10稀釋,每孔接種50μl,可使半數組織細胞管發生病變。
2.中和試驗
(1) 血清的處理 動物血清中,含有多種蛋白質成分對抗體中和病毒有輔助作用,如補體、免疫球蛋白和抗補體抗體等。為排除這些不耐熱的非特異性反應因素,用於中和試驗的血清須經加熱滅活處理。各種不同來源的血清,須採用不同溫度處理,豬、牛、猴、貓及小鼠血清為60℃;水牛、狗及地鼠血清為62℃;馬兔血清為65℃;人和豚鼠血清為56℃。加熱時間為20-30min,60℃以上加熱時,為防止蛋白質凝固,應先以生理鹽水作適當稀釋。
(2) 稀釋血清 取已滅活處理的血清,在96孔微量細胞培養板上,用稀釋液作一系列倍比稀釋,使其稀釋度分別為原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64,每孔含量為50μl,每個稀釋度作4孔。
(3) 病毒 取-70℃冰箱保存的病毒液,按經測定的毒價作200TCID50稀釋(與等量血清混合,其毒價為100TCID50)。如本例病毒價為10,50μl。所以應將病毒作2×10稀釋。
(4) 感作 每孔加入50μl病毒液,封好蓋,置於37℃溫箱中和1h。
病毒與血清混合,0℃下,不發生中反應,4℃以上中和反應即可發生。常規採用37℃作用1h,一般病毒都可發生充分的中和反應。但對易於滅活的病毒可置4℃冰箱感作,根據不同耐熱性的病毒感作溫度和時間應有所不同。
(5) 加入細胞懸液 在製備細胞懸液時,其濃度以在24h內長滿單層為度:血清病毒中和1h后取出,每孔加入100μl細胞懸液。置5%CO237℃溫箱培養,自培養48h開始逐日觀察記錄,14h終判。
由於各種病毒引起細胞病變時間不同,終判時間應根據病毒致細胞病變的快慢而定。
(6) 設立對照 為保證試驗結果的準確性,每次試驗都必須設置下列對照,特別是在初次進行該種病毒的中和試驗時,尤為重要。
陽性和陰性血清對照:陽性和陰性血清與待檢血清進行平行試驗,陽性血清對照應不出現細胞病變,而陰性血清對照應出現細胞病變。
病毒回歸試驗:每次試驗每一塊板上都設立病毒對照相,先將病毒作0.1、1、10、 100、1000 TCID50稀釋,每個稀釋度作4孔,每孔加50μl。然後每孔100μl細胞懸液。 0.1TCID TCID50應不引起細胞病變,而且100TCID TCID50必須引起細胞病變,否則該試驗不能成立。
血清毒性對照相:為檢查被檢血清本身對細胞有無任何毒性作用,設立被檢血清毒性對照是必要的。即在組織細胞中加入低倍稀釋的待檢血清(相當於中和試驗中被檢血清的最低稀釋度)。
正常細胞對照相:即不接種病毒和待檢血清的細胞懸液孔。正常細胞對照應在整個中和試驗中一直保持良好的形態和生活特徵,為避免培養板本身引起試驗誤差,應在每塊板上都設立這一對照。
(7) 結果判定和計算 當病毒回歸試驗,陽性、陰性、正常細胞對照相,血清毒性對照全部成立時,才能進行判定,被檢血清孔出現100%CPE判為陰性,50%以上細胞出現保護者為陽性;固定病毒稀釋血清中和試驗的結果計算,是計算出能保護50%細胞孔不產生細胞病變的血清稀釋度,該稀釋度即為該份血清的中和抗體效價。
用Reed和Muench兩氏法(或Karber法)計算結果,如表2-26
80%-50%
距離比例= ────── =0.5
80%-20%
Ig TCID50=高於50%血清稀釋度的對數-距離比例×稀釋係數的對數
Ig TCID50=-1.5-0.5×(-0.3)=-1.35
表2-26 固定病毒-稀釋血清法中和抗體效價計算
血清稀釋
CPE數總孔數
CPE數
無CPE數
積累
CPE比率
百分數
CPE
無CPE
1:4(10)
0/4
0
4
0
12
0/12
0
1:8(10)
0/4
0
4
0
8
0/8
0
1:16(10)
1/4
1
3
1
4
1/5
20
1:32(10)
3/4
3
1
4
1
4/5
80
1:64(10)
4/4
4
0
8
0
8/8
100
則TCID50=10,50μl
因10=1/22,即1:22的血清可保護50%細胞不產生病變,1:22就是該份血清的中和抗體效價。
影響中和試驗的因素:
(1) 病毒毒價的準確性是中和試驗成敗的關鍵,毒價過高易出現假陰性能,過低會出現假陽性。在微量血清中和試驗中,一般使用100-500 TCID50。
(2) 用於試驗的陽性血清規戒律,必須是用標準病毒接種易感動物製備的。
(3) 細胞量度的多少與試驗有密切關係,細胞量過大或過小易造成判斷上的錯誤,一般以在24h,內形成單層為宜。
(4) 毒價測定的判定時間應與正式試驗的判定時間相符。

3試驗應用

1.病毒株的種型鑒定:中和試驗具有較高的特異性,利用同一病毒的不同型的毒株或不同型標準血清,即可測知相應血清或病毒的型,所以,中和試驗不但可以定屬而且可以定型。
2.測定血清抗體效價:中和抗體出現於病毒感染的較早期,在體內的維持時間較長。動物體內中和抗體水平的高低,可顯示動物抵抗病毒的能力。
3.分析病毒的抗原性:毒素和抗毒素亦可進行中和試驗,其方法與病毒中和試驗基本相同。
用組織細胞進行中和試驗,有常量法和微量法兩種,因微量法簡便,結果易於判定,適於作大批量試驗,所以近來得到了廣泛的應用。
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