1概念

是指光路(激發和發射)在兩個位置上聚焦。在共聚焦掃描儀中,激發光聚焦在樣品點表面,而發射光聚焦在針孔上。這一針孔限制儀器在樣品表面的聚焦深度,有效防止雜質信號(如灰塵熒光、樣品背面的污染、玻璃的熒光信號、空氣中常見的灰塵顆粒和來自掃描儀光學組件的熒光污染)產生的背景噪音干擾,從而降低背景信號的強度。

2歷史

20 世紀 50 年代中期,當 Marvin Minsky在哈佛大學讀博士后的時候提出了共聚焦顯微鏡的基本概念,並於 1957 年申請了技術專利。Minsky的發明並沒有馬上引起人們的注意,主要原因是沒有足夠強度的光源,並且當時計算機的能力還不足以處理大量的數據。90 年代,光學和電子技術的發展產生了更穩定和更強的激光、更高效的掃描鏡片組、高效能的光纖、更精細的鍍膜技術和更低噪音的檢測器。此外,更多的適合固定波段激發的熒光染料也被不斷的合成。相應的計算機處理器速度快速發展,圖像顯示技術增強和大容量的存儲設備的產生也都在實際上推動了激光掃描共聚焦顯微鏡應用的迅速增加。 共聚焦顯微鏡已經逐漸成為分子、細胞和活體組織研究的常規研究設備。這在幾年以前還是不可想象的事情。

3顯微鏡

優缺點
共聚焦顯微鏡最基本的優點是可以對厚熒游標本(可以達到 50 µm或以上)進行精細
的光學切片,切片的厚度約為 0.5到 1.5µm。系列光學切片圖像可以通過精確的顯微鏡 Z 軸步進馬達上下移動標本獲得。圖像信息的採集被控制在精確的平面內,而不會被位於標本上其他位置發出的信號干擾。在去除背景熒光影響和增加信噪比后,共聚焦圖像的對比度和解析度比傳統場式照明熒光圖像有明顯的提高。

4成像大賽

作品欣賞
羽

  羽

作品說明:翠蘭斑鳳蝶翅膀鱗片是天然的生物光子晶體,使用SLO3100獲取圖像,photoshop後期上色。圖片的淺景深效果較好,類似微距照,有些可觀性。
吵架

  吵架

作品簡介:本圖是肝癌細胞HepG2,沒有做任何加工,旋轉45度做了鏡像對稱,形狀酷似兩隻雞在「吵架」。

5共焦顯微

共焦顯微技術是由美國科學家M.Minsky在1957年提出的,當時的主要目的是消除普通光學顯微鏡在探測樣品時產生的多種散射光。20世紀60年代通過提高掃描精度突破了普通寬場成像的解析度限制,在20世紀80年代研製成商用共焦顯微鏡。共焦顯微鏡分為普通光照明激發和激光照明激發兩種類型,而以後者應用最為廣泛。
激光掃描共聚焦顯微鏡(Lsaer scanning confocal microscope,LSCM)是一種先進的分子生物學和細胞生物學研究儀器。它在熒光顯微鏡成像的基礎上加裝激光掃描裝置,結合數據化圖像處理技術,採集組織和細胞內熒游標記圖像,在亞細胞水平觀察鈣等離子水平的變化,並結合電生理等技術觀察細胞生理活動與細胞形態及運動變化的相互關係。由於它的應用範圍較廣泛,已成為形態學、分子細胞生物學、神經科學和藥理學等研究領域中很重要的研究技術。
構造
共聚焦掃描顯微鏡
共聚焦顯微鏡主要由五部分組成:顯微光學系統、掃描裝置、光源、檢測器和應用軟體系統。整套儀器由計算機控制,各部件之間的操作切換都可在計算機操作平台界面中方便靈活地進行。(1)顯微光學系統:
顯微鏡是共焦檢測系統常用的組件,是系統成像質量的核心部分。顯微鏡光路一般採用無限遠光學系統結構,可以方便地在其中插入光學元件而不影響成像質量和測量精度。物鏡應選取大數值孔徑、平場復消色差物鏡,有利於熒光的採集和成像的清晰。物鏡組的轉換、濾色片組的選取、載物台的移動調節、焦平面的記憶鎖定等都可以由計算機自動控制。
(2)掃描裝置:
掃描裝置是激光共聚焦檢測系統進行大範圍檢測必需的組件,通常有由絲杠導軌組成的XY平移掃描、由陣鏡擺動的掃描等方式。前種掃描方式可以實現大範圍區域的掃描,而後者掃描範圍相對小一些,不過陣鏡擺動掃描可以很快,圖像採集速度可以大大提高,有利於對那些壽命短的離子作熒光測定。掃描系統的工作程序由計算機自動控制,與信號採集相對應。
(3)光源:
光源有單色光(激光)和多色光(汞燈、氘燈、鹵素燈等)。激光源可以使用多譜線氬離子激光器,它提供發射波長為457nm、488nm和514nm的藍綠光;另外,氦氖綠激光器提供發射波長為543nm的綠光,氦氖紅激光器提供波長為633nm的紅光。激光源還可以用其他半導體激光器。
(4)檢測器:
檢測器通常採用光電倍增管(PMT)、光子計數器等,通過高速A/D轉換器,將信號輸入計算機以便進行圖像重建和分析處理。通常在PMT前設置針孔,可以採用固定大小針孔或由計算機軟體來控制的可變大小針孔。如果是檢測熒光,光路中還應該設置能自動切換的濾色片組,滿足不同測量的需要;也可以採用光柵或稜鏡分光然後進行光譜掃描。
(5)應用軟體系統:
應用軟體系統可以根據具體需要設置各種功能,但有一點是共同的,就是將掃描位置坐標與檢測器接收的信號一一對應起來,並以圖像的方式進行儲存與顯示。
應用
共聚焦顯微鏡有較高的解析度,而且能觀察到樣本隨時間的變化。因此,共聚焦顯微技術在生物學研究領域起著不可或缺的作用。以下為共焦顯微技術的幾個主要應用方面:
(1)組織和細胞中熒游標記的分子和結構的檢測:
利用激光點掃描成像,形成所謂的「光學切片」,進而可以利用沿縱軸上移動標本進行多個光學切片的疊加形成組織或細胞中熒游標記結構的總體圖像,因此可以用於觀察切片和一些表面不平的標本,特別是研究具有長突起的神經元時更有使用價值。同時可以做三維圖像重建和標記強度的半定量分析。
(2)定量或半定量測量Ca2+和pH等細胞內離子濃度及變化:
激光掃描共聚焦顯微鏡可以提供更好的亞細胞結構中鈣離子濃度動態變化的圖像,這對於研究鈣等離子細胞內動力學有意義。最好與電生理等技術相結合來觀察離子變化與電生理學指標的相關性。
(3)熒光光漂白及恢復技術:
利用高能量激光束將細胞內某一部分中選定靶區域的某種熒光淬滅,然後觀察鄰近相同的熒游標記物重新擴散入該區域的速度和方式,從而分析細胞內蛋白質運輸、受體在細胞膜上的流動和大分子組裝等細胞生物學過程。
(4)長時程觀察細胞遷移和生長:
激光掃描共聚焦顯微鏡的軟體一般均可自動控制地進行定時和定方式的激光掃描,而且由於新一代激光掃描共聚焦顯微鏡的探測效率的提高,只需要很小的激光能量就可以達到較好的圖像質量,從而減小了每次掃描時激光束對細胞的損傷,因此,可以用於數小時的長時程定時掃描,記錄細胞遷移和生長等細胞生物學現象。
(5)其他的生物學應用:
用高能量激光束進行細胞損傷和損毀實驗,一般要用紫外激光束進行細胞損毀;細胞間通訊研究;光解籠鎖活化技術等。

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