1簡介

冰凍切片(frozen section)是一種在低溫條件下使組織快速冷卻到一定硬度,然後進行切片的方法。
冰凍切片
因其製作過程較石蠟切片快捷、簡便,而多應用於手術中的快速病理診斷。冰凍切片的種類較多,有低溫恆冷箱冰凍切片法,二氧化碳冰凍切片法,甲醇循環製冷冰凍切片法等。這些方法,隨著時代的變遷,科技的發展,許多年前被認為是非常重要的技術,現在也逐步被淘汰了。當然有些技術,如低溫恆冷箱冰凍切片法,正在受到青睞。

2冰凍切片的應用

(1)在手術進行中,突然發現病人的病變與原診斷,原定手術方案不相符合,或者懷疑時,需要病理確定。
(2)了解淋巴結內是否有轉移的腫瘤細胞,或者轉移的程度,以利於確定是否需要徹底掃除淋巴結或者其它的治療措施。
(3)對於已確定為惡性腫瘤的患者,則需要了解其手術範圍是否足夠,上下切緣是否有殘存的腫瘤組織。
(4)在做剖腹探查時所發現的腫塊或者異樣的組織。
(5)顯示組織中的脂肪和脂類物質,這常見於某些病例如脂肪瘤及肉瘤,某些科研組織等。
(6)某些酶的顯示如ATP酶,琥珀酸脫氫酶等。
(7)神經病理學技術中的某些染色法如:Eager氏法,Marchi氏法,Cajal氏法,Hortega氏法和Holzer氏法等。
(8)對某些物質所進行的免疫熒光的研究。

3術中為何做冰凍切片

病理檢查首先需要將切下的病變組織器官作一系列技術處理,包括固定、取材、脫水、浸蠟、包埋、切片和染色等,一般需花費24小時方可完成全部製片過程,然後由病理醫生用顯微鏡觀察,並做出診斷。這種檢查方法稱為常規石蠟切片,是病理檢查中最常用的方法。但是,這種方法從外科醫生將病變組織切下,到做出病理診斷,前後通常需要3天的時間。有時外科醫生希望在手術過程中馬上了解病變的性質,以便及時確定手術範圍,並做出相應的處理,就要求病理醫生在手術過程中做出病理診斷,此時就必須快速切片診斷,快速冰凍切片是目前應用的最廣泛的方法。
快速冰凍切片是用於手術中病理診斷的一種方法,病理醫生在收到手術標本后約l5分鐘之內做出診斷,馬上電話告訴手術醫生,以便迅速作出下一步治療決策。病理診斷的正確與否直接關係到手術台上處理患者的下一個步驟,如乳腺腫塊切除后的冰凍報告是良性的纖維腺瘤,則可宣告手術結束;如冰凍報告是乳腺癌,就需要進一步擴大手術範圍,切除整個乳房及腋窩淋巴結;肢體的惡性腫瘤如骨肉瘤,通常需截肢。冰凍切片病理診斷對手術治療有重大幫助和指導意義,診斷要力求正確、迅速和可靠。
然而,快速冰凍切片要在如此之短的時間內做出診斷,難度相當高,取材有局限性,製作切片的質量也不如常規石蠟切片高。因此,冰凍切片的確診率比常規切片低,有一定的延遲診斷率和誤診率。目前,冰凍切片診斷尚不能廣泛應用,即使選擇性應用,事後仍需用常規石蠟切片對照和存檔。
快速冰凍切片主要用於下列幾種情況:
①確定病變是否為腫瘤;
②判斷腫瘤的良惡性;
③了解腫瘤有無播散到鄰近淋巴結或臟器;
④確定手術切緣有無腫瘤浸潤,以了解手術範圍是否足夠大;
⑤幫助識別手術中某些意外和確定可疑微小組織(如甲狀旁腺、輸卵管或輸精管等);
⑥取新鮮組織供激素受體測定、腫瘤葯敏試驗、電鏡檢查和分子生物學檢查等特殊需要。

4冰凍切片的製作方法

低溫恆冷箱冷凍切片製作法
以Shandon As 620 E型恆溫箱冷凍切片機為例,該機的箱面上有電子控制板,裝有即時冷凍鍵和除霜鍵,啟動即時冷凍鍵,機器馬上進行工作狀態,並可持續10mins。啟動即時除霜鍵,可將工作間頂部後面的製冷柵上的霜除掉,並可持續15mins。有照明鍵一個,啟動該鍵可照明工作間,有利工作及觀察組織的冰凍狀況。配有消毒鍵一個,當進行一周的工作或者一天的工作后,啟動該鍵,可對工作間進行消毒。當每天工作完畢時,可啟動密鎖鍵,鎖住工作間。除此之外,箱面的左邊有四個按鍵,兩個為快速自動進退鍵,兩個為微小進退鍵,還有一個手動旋鈕,調節修組織塊時的進退。
冷凍箱內左邊的冷凍台,溫度可達-60℃左右,冷凍箱的中間為一台切片機,工作間的溫度在0-30℃間可任意調節,並在箱面上的熒屏顯示出來。
冰凍切片時的注意事項
①防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應保持乾淨,需經常用毛筆挑除切片殘餘和用柔軟的紙張擦。有時需要每切完一張切片后就用紙擦一次。因為這個地方是切片通過和附貼的地方,如果有殘餘的包埋劑粘於刀或板上,將會破壞甚至撕裂切片,便切片不能完整切出。
②多例多塊組織同時需做冰凍切片時,可各自放於不同的支承器上,於冷凍台上凍起來,然後依據不同的編號,依序切片,這樣做既不費時也不會亂。
③放置組織冰凍前,應視組織的形狀及走勢來放置,所謂「砍柴看柴勢」,切片也是如此,如果胡亂放置,就不能收到很好的效果。
④組織塊不須經各種固定液固定,尤其是含水的固定液,在未達到固定前,更不能使用。臨床快速冰凍切片,不須要預先固定,一是為了爭取時間,二是固定了的組織,反而增加了切片的難度。如果使用未完全固定的組織做冰凍切片,就會出現冰晶。這是因為含水的固定液在組織未經固定前,其中的水份也可滲入到組織中去,當冰凍發生時,這些水份就存留於組織中,形成了冰晶。
⑤當切片時,如果發現冰凍過度時,可將冰凍的組織連同支承器取出來,在室溫停留片刻,再行切片,或者用口中哈氣,或者用大拇指按壓組織塊,以此來軟化組織,再行切片。另者,調高冰凍點。
⑥用於附貼切片的載玻片,不能存放於冷凍處,於室溫存放即可。因為當附貼切片時,從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差,當溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時,由於兩種物質間溫度的差別,當它們碰撞在一起時,分子彼此間發生轉移而產生了一種吸附力,使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來附貼切片,由於溫度相同,沒有發生上述的現象。
優點
1.簡便,可以不需要對組織固定、脫水、透明、包埋等手續即可進行切片,減少了一些中間環節。
2.快速,用時短。
3.組織變化不大。
4.能很好保存脂肪,類脂等成分。
5.能夠比較完好地保存各種抗原活性及酶類,特別是對於那些對有機溶劑或熱的溫度耐受能力較差的細胞膜表面抗原和水解酶保存較好。
新鮮的組織製備
組織儘可能新鮮、驟冷愈快愈好,才能避免冰晶,常用的驟冷劑有:① CO2氣(-78℃) ② 丙酮乾冰冷卻的輕石油醚、乙烷和庚烷(-80℃) ③ 液氮(-190℃)④ 液氮冷卻的丙烷(-19℃)。液氮適用於組織化學,較安全。缺點:組織塊易發生龜裂。
恆冷箱溫度
一般在冷凍后10分鐘,到接近冷室溫度時再切,一般組織在-15~-20℃切片最易成功。每種組織有其合適的切片溫度、刀的溫度和冷室溫度,Pearse及Bancroft的經驗如下:
組織 刀溫度 組織溫度 恆冷箱溫度
肝 -18 -10 -5
腎 -15 -8 -5
皮膚 -35 -10 -5
腦 -18 -5 -5
固定組織一般高3-5度
冰凍乾燥
原理
  為冰凍組織保持高度真空,直到去除組織中的水分。
過程
  小塊組織驟冷→立即在真空乾燥脫水(-30~-40℃)冰升華,水氣去除,不會發生酶的彌散→材料干后,升到室溫浸於石蠟或碳蠟包埋。
特點
  能出色地保存組織的酶活性,還有助於保持組織的結構。但儀器貴,需時長。

冰凍替代法

原理
  低溫下用液體脫水劑取代組織中的水分。
過程
  組織塊驟冷→組織內的水,在低溫(-40℃~-70℃)液體脫水劑中被替代(醇、丙酮),同時起到固定作用→脫水組織漸恢復到室溫,用石蠟包埋。
特點
  ① 新鮮組織在24小時內製成切片
② 可保存較多的酶活性
③ 經濟、簡單且有重複性,但對細胞器保存不佳,不能用於電鏡。

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