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溶膠或溶液中的膠體粒子或高分子在一定條件下互相連接,形成空間網狀結構,結構空隙中充滿了作為分散介質的液體(在干凝膠中也可以是氣體),這樣一種特殊的分散體系稱作凝膠。沒有流動性。內部常含有大量液體。例如血凝膠、瓊脂的含水量都可達99%以上。可分為彈性凝膠和脆性凝膠。

1 凝膠 -概述

一種特殊的分散體系,其中膠體顆粒或高聚物分子相互連接,搭成架子,形成空間網狀結構,液體或氣體充滿在結構空隙中。其性質介於固體和液體之間,從外表看,它成固體狀或半固體狀,有彈性;但又和真正的固體不完全一樣,其內部結構的強度往往有限,易於破壞。

可分為彈性凝膠和脆性凝膠。彈性凝膠失去分散介質后,體積顯著縮小,而當重新吸收分散介質時,體積又重新膨脹,例如明膠等。脆性凝膠失去或重新吸收分散介質時,形狀和體積都不改變,例如硅膠等。由溶液或溶膠形成凝膠的過程稱為膠凝作用(gelation)。

2 凝膠 -分類

凝膠是個總的名稱,根據分散相質點的性質(剛性還是柔性)和形成結構時質點間連接的性質(結構的強度),可分為剛性凝膠與彈性凝膠兩大類。多數的無機凝膠,如二氧化硅、三氧化二鐵、二氧化鈦、五氧化二釩等屬於前者;而柔性的線型高聚物分子形成的凝膠,如橡膠、明膠、瓊脂等屬於後者。也可將凝膠分為可逆凝膠與不可逆凝膠兩大類。   

3 凝膠 -製備

 溶液或固體(干凝膠)都能形成凝膠。從固體製備凝膠比較簡單,干膠吸收液體膨脹即成,通常為彈性凝膠。從溶液製備凝膠須滿足兩個基本條件:①降低溶解度,使固體物質從溶液中成「膠體分散態」析出;②析出的固體質點既不沉降,也不能自由移動,而是搭成骨架形成連續的網狀結構。具體的製備方法可以有:①冷卻膠體溶液,產生過飽和溶液。如0.5%瓊脂溶液冷到35℃就形成固體狀膠凍;②加入非溶劑,例如果膠水溶液加入酒精后就形成凝膠;③加入鹽類,適量的電解質加入到膠粒的親水性較強尤其是形狀不對稱的疏液溶膠中,即可形成凝膠,如五氧化二釩、氫氧化鐵等;④化學反應,利用化學反應產生不溶物,並控制反應條件可得凝膠,如硅膠的製備。   

4 凝膠 -性質

凝膠的膨脹作用

彈性凝膠由線型高分子構成,因分子鏈有柔性,故吸收或釋出液體時很易改變自身的體積,其吸收液體使自身體積增大的現象稱為膨脹作用。這種作用具有選擇性,只能吸收對它來講是親合性很強的液體。其膨脹可以是有限的,也可以是無限的,與其內部結構連接的強度有關,改變條件也可使有限膨脹變成無限膨脹,即膨脹的結果是完全溶解和形成均相溶液。

根據膨脹機理的研究,可以認為膨脹過程分為兩個階段,第一階段是溶劑分子鑽入凝膠中與大分子相互作用形成溶劑化層,此過程時間很短,速度快;第二階段是液體的滲透作用,此過程中凝膠吸收大量液體,體積大大增加。在膨脹過程中由於溶劑分子進入凝膠結構中的速度遠大於大分子擴散到液體中的速度,使凝膠內外溶液濃度有很大差值,即溶劑的活度有很大差異,產生膨脹壓。此值很可觀,例如明膠濃度為50%時,膨脹壓為13千克力/厘米2,66%時為45千克力/厘米2。古代埃及人曾利用木頭吸水時產生很大的膨脹壓來開採建造金字塔的石料,即所謂濕木裂石。

凝膠的脫水收縮作用  

凝膠在老化過程中會發生特殊的分層現象,稱為脫水收縮作用或離漿作用,但析出的一層仍為凝膠,只是濃度比原先的大,而另一層也不是純溶劑,是稀溶膠或高分子稀溶液。一般來說,彈性凝膠的離漿作用是個可逆過程,它是膨脹作用的逆過程;剛性凝膠的離漿作用是不可逆的。

脫水收縮現象的實際例子很多,如人體衰老時皮膚的變皺、面制食品的變硬、澱粉漿糊的「乾落」等。

凝膠中的擴散與化學反應  

凝膠和液體一樣,作為一種介質,各種物理過程和化學過程都可在其中進行。物理過程主要是電導和擴散作用,當凝膠濃度低時,電導值與擴散速度和純液體幾乎沒有區別,隨著凝膠濃度的增加,兩者的值都降低。利用凝膠骨架空隙的類似分子篩的作用,可以達到分離不同大小分子的目的,這就是近年來發展很快的凝膠電泳與凝膠色譜法。凝膠中的化學反應進行時因沒有對流存在,生成的不溶物在凝膠內具有周期性分佈的特點。自然界中有許多類似的現象,如瑪和玉石的周期性結構;植物體與動物體中也常遇到,如膽結石。  

5 凝膠 -應用

凝膠在國民經濟與人們日常生活中佔有重要地位。工業上,橡膠軟化劑的應用,皮革的鞣製,紙漿的生產,吸附劑、催化劑和離子交換劑的使用;生物學和生理學中有重要意義的細胞膜,紅血球膜和肌肉組織的纖維都是凝膠狀物體。不少生理過程,如血液的凝結、人體的衰老等都與凝膠作用有關。

6 凝膠 -生物學和凝膠

 生物分子下游純化的對象一般包括蛋白、酶、重組蛋白、單抗、抗體及抗原、肽類、病毒、核酸等。純化前首先需要測定生物分子的各物理和化學特性,然後通過實驗選擇出最有效的純化流程。 

1.測定——分子量、PI 

當目標蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚時,可用PAGE電泳方法或層析方法加以測定。分離範圍廣闊的Superose HR預裝柱很適合測定未知蛋白的分子量。用少量離子交換介質在多個含不同PH緩衝液的試管中,可簡易地測出PI,並選擇純化用緩衝液的最佳PH. 

2.選擇——層析方法 

若對目標蛋白的特性或樣品成分不太了解,可嘗試幾種不同的純化方法: 

使用最通用的凝膠過濾方法,選擇分離範圍廣闊的介質如Superose、Sephacryl HR依據分子量將 樣品分成不同組份。 

用含專一配體或抗體的親和層析介質結合目標蛋白。亦可用各種活化偶聯介質偶聯目標蛋白的底物、受體等自製親和介質,再用以結合目標蛋白。一步即可得到高純度樣品。 

體積大的樣品,往往使用離子交換層析加以濃縮及粗純化。高鹽洗脫的樣品,可再用疏水層析純化。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理,洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析。兩種方法常被交替使用於純化流程中。 

3.純化——大量粗品 

處理大量原液時,為避免堵塞柱子,一般使用sepharose big beads、sepharoseXL、sepharose fast flow等大顆粒離子交換介質。擴張柱床吸附技術利用多種STREAMLINE介質,直接從含破碎細胞或組織萃取物的發酵液中俘獲蛋白。將離心、超濾、初純化結合為一。提高回收率,縮短純化周期。 

4.純化——硫酸氨樣品 硫酸氨沉澱方法常被用來初步凈化樣品,經處理過的樣本處於高鹽狀態下,很適合直接上疏水層析。若作離子交換,需先用Sephadex G-25脫鹽。疏水層析是較新技術,隨著介質種類不斷增多,漸被融入各生產工藝中。利用Hitrap HIC Test Kit 和RESOURCE HIC Test Kit可在八種疏水介質中選擇最適合介質及最佳的純化條件。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其它吸附性層析。 

5.純化——糖類分子 
  固化外源凝訂素如刀豆球蛋白、花生、大麥等凝集素,可結合碳水化合物的糖類殘基,很適合用作分離糖化細胞膜組份、細胞、甚至亞細胞細胞器,純化糖蛋白等。兩種附上外源凝集素的Sepharose 6MB親和層析介質,專為俘獲整個細胞或大複合物,如膜囊等。 

6.純化——膜蛋白 
  膜蛋白分離常使用去污劑以保持其活性。離子性去污劑應選用與目標蛋白相反電荷者,避免在作離子交換時和目標蛋白競爭交換介質,籍此除去去污劑。非離子性去污劑可以疏水層析除去。 

7.純化——單抗、抗原 *單抗多為IgG.來源主要是腹水和融合瘤培養上清液。腹水有大量白蛋白、轉鐵蛋白和宿主抗體等。Mabselect、Protein G和Protein A對IgG的Fc區有專一性親和作用,能一步純化各種不同源的IgG.血清互補劑如小牛血清可先用蛋白G預處理,在培養前除去IgG.重組蛋白A介質Mabselect和rProtein A Sepharose FF對IgG有更高的載量和專一性,基團脫落更少。脫落的rProtein A用離子交換Q Sepharose HP或凝膠過濾Superdex 200,很容易去除。 
  *疏水層析Phenyl Sepharose HP亦很適合純化IgG.宿主抗體和污染IgG可用凝膠過濾Superdex 200在精細純化中去除。 
  *純化IgG抗原最有效的方法是用活化偶聯介質如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶聯IgG,再進一步獲取IgG抗原。 
  *HiTrap IgM是用來純化融合瘤細胞培養的單抗IgM,結合量達5mg IgM.HiTrap IgY是專門用來純化IgY,結合量達100mg純IgY. 

8.純化——重組蛋白 重組蛋白在設計、構建時應已融入純化構想。樣品多夾雜了破碎細胞或溶解產物,擴張柱床吸附技術STREAMLINE便很適合做粗分離。Amersham biosciences提供三個快速表達、一步純化的融合系統。 
  一] GST融合載體使要表達的蛋白和谷胱甘肽S轉移酶一起表達,然後利用Glutathione Sepharose 4B作親和層析純化,再利用凝血酶或因子Xa切開。 
  2. 蛋白A融合載體使要表達的蛋白和蛋白A的IgG結合部位融合在一起表達,以IgG Sepharose 6 FF純化。 
  二] 含組氨酸標記(Histidine-tagged)的融合蛋白可用Chelating Sepharose FF螯合Ni2+金屬,在一般或變性條件(8M尿素)下透過組氨酸螯合融合蛋白。HisTrap試劑盒提供整套His-Tag蛋白的純化方法。 

9.純化——包涵體蛋白 
  包涵體蛋白往往需溶於6M鹽酸胍或8M尿素中。高化學穩定性的Superose 12及Sepharose 6FF凝膠過濾介質很適合在變性條件下做純化。變性純化后的蛋白需要復性至蛋白的天然構象。Superdex 75、Q Sepharose FF和Phenyl Sepharose FF分別被發現有助包涵體蛋白的復性。一般包涵體蛋白樣品的純度越高,復性效果越好。SOURCE 30 RPC反相層析介質很適合純化復性前的粗品,並可以1MnaOH重生。此方法純化后的包涵體蛋白,復性回收率明顯提高。 

10.包涵體蛋白固相復性 *近年許多文獻報導將包涵體蛋白在變性條件下固定(吸附)在層析介質上,一般用各種Sepharose FF離子交換層析介質。去除變性劑后,蛋白在介質上成功復性,再將復性好的蛋白洗脫下來。固相復性避免了一般復性過程中蛋白質聚體的形成,所以復性得率更高,而且無需大量稀釋樣品,並將復性和初純化合二為一,大大節省時間及提高回收率。 
  *固相復性方法也被用於以HiTrap Chelating金屬螯合層析直接復性及純化包涵體形式表達的組氨酸融合蛋白;以HiTrap Heparin肝素親和層析直接復性及純化包涵體形式表達的含多個賴氨酸的融合蛋白。兩種親和層析預裝柱均可反覆多次重複使用,比一般試劑盒更方便、耐用。 

11.純化——中草藥有效成分 
  中藥的化學成分極其複雜。傳統中藥多是煎熬后服用,有效成份多較為親水,包括生物鹼、黃酮、蒽醌、皂甙、有機酸、多糖、肽和蛋白質。靈活及綜合性地利用多種層析方法。如離子交換、分子篩、反相層析,更容易分離到單一活性成分。Sephadex LH-20葡聚糖凝膠同時具備吸附性層析和分子篩功能,例:如用甲醇分離黃酮甙,三糖甙先被洗下來,二糖甙其次,單糖甙隨後,最後是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各種試劑,廣泛用於各種天然產物的分離,包括生物鹼、甙、黃酮、醌類、內脂、萜類、甾類等。 
  *生物鹼在酸性緩衝液中帶正電,成為鹽,HiTrap SP陽離子交換層析柱可以分離許多結構非常近似的生物鹼。相反,黃酮、蒽醌、皂甙、有機酸等可溶於偏鹼的緩衝液中,在HiTrap Q陰離子交換柱上分離效果良好。 
  *一般多糖純化大多使用分子篩如Sephadex,Sephacryl.若分子量在600KD以下,並需更高解析度,可選擇新一代的Superdex.一般植物可能含水溶性、酸溶性、鹼溶性多種多糖。綜合利用分子篩及離子交換層析有助進一步獲各組份純品。另外,多糖藥物需去除可引起過敏的蛋白質,傳統Sevag方法用丁醇脫蛋白需反覆數十次。陰陽離子交換法可以一、兩步快速去除多糖中殘存的蛋白質。SOURCE5、15、30RPC反相層析也很適合各種中藥有效成分的檢測、分離和放大製備。由於中藥的成分非常複雜,SOURCE反相層析可用範圍為PH1-14 ,並可用1M NaOH,1M HCL清洗、再生。比傳統硅膠反相層析更易於工藝優化及在位清洗,壽命也更長。 

12.純化——肽類 

肽類的來源有天然萃取,合成肽和重組肽三種。肽容易被酶降解,但可從有機溶劑或促溶劑中復性,所以多以高選擇性的反相層析如SOURCE 30RPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或離子交換Minibeads、Monobeads作純化。Superdex Peptide HR是專為肽分子純化設計的凝膠過濾預裝柱,能配合反相層析做出更精美的肽圖。肽分子製備可用離子交換配合凝膠過濾Superdex 30 PG。醫學都市多功能 

13.純化——核酸、病毒 

核酸的純化用於去除影響測序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分為質粒DNA、噬菌體DNA和PCR產物等。病毒也可視作核酸大分子,和質粒DNA一樣,可用分離大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝膠過濾介質去除雜蛋白,再配合離子交換如Mono Q、 SOURCE Q分離核酸。 

14.純化——寡核苷酸寡酸苷酸多應用在反義(anti-sense)DNA、RNA測序、PCR和cDNA合成等研究。合成后含三苯甲基的寡核苷酸以陰離子交換的Mono Q或快速低反壓的SOURCE Q在PH12下可除副產物,並避免凝集和保護基的脫落。載量大大高過反相層析,可用做大量製備。不含三苯甲基的失敗序列可用反相柱ProRPC去除。 

15.脫鹽、小分子去除 

使用凝膠過濾介質Sephadex G10,G15,G25,G50等去除小分子,效率高,處理量可達床體積30%.只需在進樣后收集首1/3-1/2柱體積的洗脫液,就可以去除該填料分離範圍上限以下的小分子,簡單直接。由於只是去除小分子,柱高10cm以上即可。整個過程一般可於數分鐘至半小時完成。Sephadex G25系列介質專為蛋白質脫鹽而設計,預裝柱HiTrap Desalting(5ml)可用針筒操作。HiPrep Desalting(26ml)可在數分鐘為多至10ml樣品脫鹽。 

16.疫苗純化 使用凝膠過濾介質Sepharose 4FF純化疫苗,去除培養基中的雜蛋白,處理量可大於床體積10%.柱高一般40-70cm,整個過程約半至一小時。目前使用此法生產的疫苗品種有乙肝、狂犬、出血熱、流感、肺結核、小兒麻痹疫苗等。分子量較小的疫苗可使用Sephacryl S-500HR,如甲肝疫苗等。 

17.抗生素聚合物分析 

中國藥典從2000年版起要求抗生素頭孢曲松鈉需要找出聚合物占產品的白分比,規定使用Sephadex G10凝膠過濾法測定。 

18.純化-基因治療用病毒載體 

SORRCE 15Q 

19.純化-基因治療用質粒 
  Q Sepharose XL,SOURCE 15Q,STREAMLINE Q,Sephacryl S500,Plasmidselect 在下游純化中,可應用不同層析技術在純化生物分子的同時,去除各種污染物。

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