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分子原位雜交

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分子原位雜交是生物學上的專有名詞,指的是利用一段順序的單鏈DNA或RNA作探針,與解鏈的染色體上的DNA單鏈進行原位雜交,確定DNA或RNA所在位置。

1 分子原位雜交 -定義

分子原位雜交:利用一段順序的單鏈DNA或RNA作探針,與解鏈的染色體上的DNA單鏈進行原位雜交,確定DNA或RNA所在位置。 原位雜交技術就是利用放射性或非放射性標記的已知核酸探針,通過放射自顯影或非放射檢測系統在組織、細胞及染色體上檢測特異DNA或RNA序列的一種技術,是一種直接、簡便的研究基因定位和表達的方法。 原位雜交的雜交雙方是待測核酸序列及探針,待測核酸序列可以是克隆的基因片段,也可以是未克隆化的基因組DNA和細胞總RNA。核酸探針是指用放射性同位素、非放射性熒光染料直接或間接標記的,能與特定的核酸序列發生特異性互補的已知DNA或RNA片段。根據其來源和性質可分為cDNA探針、基因組DNA探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。

2 分子原位雜交 -基本原理

當溶液中的DNA分子經高溫或高PH處理后,DNA雙鏈分子會變性產生兩條單鏈,如果將溫度逐漸下降或PH恢復到中性,單鏈會按照鹼基互補配對的原則,重新形成氫鍵恢復到原來的雙鏈結構。如果兩條單鏈的來源不同,只要它們之間的鹼基順序同源互補或者部分同源互補,在條件適宜時,就可以全部或部分復性,產生分子雜交。 原位雜交技術包括有:菌落原位雜交(colony in situ hybridization)、斑點雜交法(Dot blot)、southern印跡雜交(Southern blot)、northern印跡雜交(Northern blot)、組織原位雜交(Tissue in situ hybridization)和基因組原位雜交(Genome in situ hybridization) v原位雜交組織化學技術在生命科學的研究中可視為一項革命性的技術。它使它們的研究從器官、組織和細胞水平走向分子水平。為各個學科的研究帶來突破性的進展。其中特別突出的是細胞或組織的基因表達、染色體分析、病毒診斷和發育生物學。 原位雜交技術主要步驟: 材料處理及細胞樣品的固定; 樣品的製備和預處理; 探針的製備和預雜交; 探針及樣品的變性; 雜交溫育; 檢測雜交信號,進行結果分析。 

3 分子原位雜交 -分子雜交作圖法

片段間重疊的信息來自於每個片段所含內容的部分信息。在解釋什麼是部分信息之前,必須強調的是,在這裡我們稱片段為克隆(clone)。在用不同的方式將每份目標DNA分子打碎並將片段克隆之後,我們就得到了幾千個克隆構成的集合,稱做克隆庫(clone library)。 

每個克隆的部分信息是通過雜交實驗(hybridization experiment)來獲得的。在這些實驗里,我們檢測被稱為探針(probe)的小序列可否與克隆結合或雜交,如果發生了結合,就說明該克隆包含與該探針序列互補的序列。對於同一個克隆,我們對採用不同的探針重複雜交實驗,與該克隆雜交的所有探針的集合稱為該克降的指紋。指紋重疊的兩個克隆可能來自目標叫A分子的交疊區域。例如,如果我們知道了探針人x、y、z可能與克隆A結合,而探針x、w、和z能與克降B結合,我們就很有理由相信克隆A和B互相交疊,如圖2所示(除非存在重複片段)。注意,這類信息一般並不能足以使我們確定這些探針在目標DNA中的位置,而僅能確定它們的相對順序。   
在雜交實驗中各種錯誤都可能發生。首先,探針可能結合失敗,這就產生了假陰性(False negative)的結果;其次,探針也可能結合到了不該結合的位置上,產生假陽性(false positive)結果;有時還會出現人為對實驗結果的判讀錯誤,這也可能產生假陽性或假陰性結果。有時,甚至在雜交尚未發生前錯誤就已出現。在克隆過程中,DNA分子的兩個片段可能會發生融合併像單一克隆那樣進行複製,這種克隆稱之為嵌合克隆(chimeric clone).它可使人們產生關於探針相對順序的錯誤推斷;嵌合現象常有發生,故其已成為雜交作圖中的一個嚴重問題。有估計認為在許多克隆庫中有高達40%一60%的克隆實際上是嵌合體。克隆過程中的另一類錯誤是缺失(deletion),即克隆丟失了一個內部片段,因而使目標DNA分子中兩個本不相鄰的片段連接在一起. 

另外還有兩種情況也可使雜交標圖過程出現問題。第一是探針不唯一,這意味著探針可與目標DNA分子一個以上的位點結合,這些位點序列稱為重複序列(repeat)。一種稱做序列標記位點(sequence tagged site, sts)的技術可避免這個問題,它產生的探針可與目標DNA分子上專一的位點進行雜交。第二個問題是數據缺乏,因為在雜交實驗中完成所有的雜交不太可行。分享技術(pooling technique)是解決此類問題的措施。 

4 分子原位雜交 -相關條目

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