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分子遺傳標記

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分子遺傳標記是以物種突變造成DNA片段長度多態性為基礎的,具有許多優點;(1)直接探測DNA水平的差異,不受時、空的限制;(2)標記數量豐富、多態性高;(3)共顯性標識,可以區分純合子與雜合子;(4)可以解釋家系內某些個體的遺傳變異;(5)可以鑒定不同性別、不同年齡的個體。隨著基因工程特別是DNA重組技術的發展,現在人們已確知動物不但有毛色、體態、血型、染色體等的多態性,而且有DNA水平的多態性,特別是20世紀80年代以後,研究DNA多態性的各種遺傳標記方法發展極其迅速,分子遺傳標記應用於動物育種成為現實。

目錄

1特點

應用較廣泛的分子遺傳標記有:限制性片段長度多態分析技術(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)、DNA指紋分析技術(DNA Fingerprint)、隨機引物擴增多態性DNA技術(Random Amplified Polymorphism DNA,RAPD)、STR(Short Tandem Repeats)和擴增片段長度多態性分析技術 (Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)。
1.1 RFLP分析技術
20世紀70年代中期,遺傳學家發現了RFLP現象;1980年Botstein首先提出利用RFLP作遺傳標記構建遺傳圖譜,直到1987年Donis等人才構建出第一張人的RFLP圖譜。RFLP基本原理是基因組DNA在限制性內切酶作用下,產生大小不等的DNA片段;它所代表的是基因組DNA酶切后產生的片段在長度上的差異,這種差異是由於突變增加或減少了某些內切酶位點造成的。RFLP作為遺傳標記具有其獨特性:(1)標記的等位基因間是共顯性的,不受雜交方式制約,即與顯隱性基因無關;(2)檢測結果不受環境因素影響;(3)標記的非等位基因之間無基因互作效應,即標記之間無干擾。RFLP分析技術的主要缺陷是克隆可表現基因組DNA多態性的探針較為困難,但隨著可標記多態性探針的增多,該技術將在分子生物學研究中得到更廣泛的應用。
 其原理為利用限制性內切酶消化基因組DNA,形成大小不等、數量不同的分子片段,經電泳分離,通過Southern印跡將DNA片段轉移至支持膜(尼龍膜或硝酸纖維素膜)上,然後用放射性同位素(32P)或非同位素 (如地高辛,熒光素)標記的探針與支持膜上的DNA片段進行雜交。不同基因組DNA酶切位點的改變,會使得RFLP譜帶表現出不同程度的多態性.
1.2 DNA指紋分析技術
20世紀80年代初期,人類遺傳學家相繼發現在人類基因組中存在高度變異的重複序列,並命名為小衛星DNA。它以一個基本序列(l1一60鹼基對)串連排列,因重複次數不同而表現出長度上的差異。1987年人們利用人工合成的寡核苷酸(2~4鹼基對)作探針,探測到高度變異位點,即所謂的微衛星DNA。以小衛星或微衛星DNA作探針,與多種限制性內切酶酶切片段雜交,所得個體特異性的雜交圖譜,即為DNA指紋。DNA指紋技術作為一種遺傳標記有以下特點:(1)具有高度特異性。同一物種兩個隨機個體的指紋相似係數僅為0.22,二者指紋完全相同的概率為三千億分之一;(2)遺傳方式簡明。DNA指紋遵循孟德爾遺傳定律,衛星DNA是高度變異的重複序列,所檢測的多態性信息含量較高;(3)具有高效性。同一個衛星DNA探針可同時檢測基因組中10個位點的變異,相當於數10個探針。由於衛星DNA不是單拷貝,難於跟蹤分離群體中個體基因組中同源區域的分離。
1.3 RAPD分析技術
RAPD是Williams等人(1990)發展起來的一種新型遺傳標記,儘管這一技術比較年輕,但由於其獨特的檢測DNA多態性的方式即極快速、簡捷、高效等優點,使得RAPD技術已滲透於有關基因研究的各個領域。RAPD是建立於PCR基礎之上的,利用隨機的脫氧核節酸序列作引物(一般9~10鹼基對),對所研究的基因組DNA體外擴增,擴增產物經電泳分離染色后,來檢測其多態性,這些擴增DNA片段多態性便反映了基因組相應區域的DNA多態性。RAPD標記特點是:(1)RAPD擴增引物沒有物種的限制,一套引物可用於不同物種基因組分析;(2)RAPD擴增引物沒有數量上限制,可以囊括基因組中所有位點;(3)RAPD技術簡捷方便,可進行大量樣品的篩選。RAPD標記是顯性的,無法區分動物純、雜合體,而且在分析中易產生非特異性。
1.4 AFLP分析技術
Zabean等(1993)將PCR與RFLP結合起來,創造了AFLP分析技術。基因組DNA先用限制性內切酶雙酶切,再在兩端連上特定的人工接頭,根據接頭和酶切位點的序列設計引物。一般在引物的3'端再增加1一3個鹼基進行選擇性擴增。不同樣品由於DNA序列不同,擴增出的片段數及長度各不相同,經變性的聚丙烯醯胺電泳就能區分出不同樣品之間的差異,作為遺傳標記構建連鎖圖,或鑒定與特定性狀連鎖的標記。與RFLP比較,它無需了解DNA模板序列,產生的多態性較多;與RAPD比較,它的可重複性得到極大提高。Higuch從已滅絕的斑驢皮肌中提取DNA,經PCR擴增,進行斑驢與馬的親緣關係研究,取得成功。
2、遺傳標記在家畜育種中的應用
2.1基因定位
RAPD快速尋找同一區域連鎖DNA標記的方法,可為RFLP連鎖間隔區提供新的DNA標記,或增加同一區域分子標記的密度比。由於RAPD能在一次反應中檢測基因組的多個位點,因此它可迅速找到兩組DNA樣品間多態性差異,進而得到與此差異相連鎖的DNA標記。RAPD基因定位方法主要有兩種:(1)近等位基因系的定位。它是由提供靶基因的供體親本與輪迴親本雜交、多次回交,通過每代對靶基因選擇而獲得的、除靶基因外,其它性狀大部分與輪迴親本相同的品系;因此,它的基因組DNA除目的基因所在區域與輪迴親本不同外,余者基本相同,這樣便為RAPD對兩個基因組DNA進行多態性檢測提供了可能,找出它們基因組擴增產物的差異,用這些有差異的產物做探針,再由RFLP連鎖分析定位這些基因。(2)通過對目的基因有分離的F2進行基因定位。根據F2個體中的目的基因分離構建2個基因文庫,然後從中分別隨機抽取30個樣本,分別提取其DNA,並等量混合,又形成2個新文庫,這2個新文庫對目的基因是選擇性的,而對其它部分基因則是隨機的;利用RAPD找出與目的基因區域相連鎖的DNA多態性標記,從而定位該基因。
2.2構建基因圖譜
基因圖譜是遺傳學研究的重要內容,也是家畜遺傳育種的依據。分子遺傳標記構建遺傳圖譜的原理與形態標記相同,不同的是一個分子遺傳標記分離群體,可同時獲得幾十個乃至幾百個標記;而且可以使用不同的分離群體(暫時性或永久性分離群體)。目前,已構建出牛、馬、豬等家畜的RFLP遺傳連鎖基因圖譜。
2.3背景基因型的選擇
Hilel等(1990)認為,在回交群體中,可藉助DNA指紋的輔助選擇,從而接受或拒絕某一特定的基因組背景,這樣有助於基因的導入,但微衛星標記應用於基因導入育種方案,並不具有完美的適應性。Groen等人 (1992)假設被導入基因已被定位,即可在後代中加以鑒定,而實際上是不可能的,而且被導入的QTLs與標記基因常常發生重組現象。Smith等 (1995)在Groen等研究成果的基礎上,進一步研究在不同雜交方案中表型選擇和標記輔助選擇的效率,得出結論,利用標記選擇的效果不如表型選擇。
2.4雜交選育
根據分子標記位點的雜合性預測各組合之間的雜種優勢,可極大地減少配合力測定工作。對雜交後代的鑒定和選擇是育種工作的重要內容。在傳統育種中,有些性狀無法在早期鑒定篩選而被淘汰;如果利用這些性狀連鎖的分子標記進行輔助選擇,不僅可以早期選擇,而且能在短時間內對大量後代進行鑒定。大量研究均假設群體處於連鎖不平衡狀態,並均考慮最簡單的情況一一兩近交系間的雜交。通過雜種後代(F2)實施標記輔助選擇,而後分兩個階段進行:(1)以標識一QTL連鎖測驗的估計值游標准選用標記,對此,一個重要問題是如何在群體中選擇遺傳標記,被選標記必須能夠解釋部分遺傳為方差。從基因組所有遺傳標記中選擇某些較為理想的標記,再從新的獨立樣本群對標記效應的回歸系統進行估計,這種情況下,標記的估計值是無偏的。(2)基於標識基因型和個體表型及其親屬表型進行個體選擇。
分子標記為家畜育種開闢了一條新途徑,但能否在育種實踐中發揮應有的作用,取決於下面4個因素:(1)具有與目標基因緊密連鎖的分子標記;(2)具有多態性高的分子標記繪製的遺傳圖譜;(3)能否實現分子標記分析自動化,降低成本,簡化實驗;(4)應用標記預測育種值的方法有所改進。這4個方面已取得較大的進展,隨著生物技術的深入發展與完善,分子標記在家畜育種中將發揮越來越大的作用。
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