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分子雜交技術

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互補的核苷酸序列通過Walson-Crick鹼基配對形成穩定的雜合雙鏈分子DNA分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的,可以根據所使用的探針已知序列進行特異性的靶序列檢測。

1技術簡介

雜交的雙方是所使用探針和要檢測的核酸。該檢測對象可以是克隆化的基因組DNA,也可以是細胞總DNA或總RNA。根據使用的方法被檢測的核酸可以是提純的,也可以在細胞內雜交, 即細胞原位雜交。探針必須經過標記,以便示蹤和檢測。使用最普遍的探針標記物是同位素, 但由於同位素的安全性,近年來發展了許多非同位素標記探針的方法,多使用甾類化合物地高辛配基(digoxigenin,DIG)標記。
核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度的特異性,因而該技術在分子生物學領域中已廣泛地使用於克隆基因的篩選、酶切圖譜的製作、基因組中特定基因序列的定性、定量檢測和疾病的診斷等方面。因而它不僅在分子生物學領域中具有廣泛地應用,而且在臨床診斷上的應用也日趨增多。

2核酸探針標記法

核酸探針根據核酸的性質,可分為DNA和RNA探針;根據是否使用放射性標記物的與否,可分為放射性標記探針和非放射性標記探針;根據是否存在互補鏈,可分為單鏈和雙鏈探針;根據放射性標記物摻入情況,可分為均勻標記和末端標記探針。下面將介紹各種類型的探針及標記方法。
隨機引物合成法
隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探針。合成產物的大小、產量、比活性依賴於反應中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,產物平均長度為400-600個核苷酸。利用隨機引物進行反應的優點是:(1)Klenow片段沒有5'→3'外切酶活性,反應穩定,可以獲得大量的有效探針。(2)反應時對模板的要求不嚴格,用微量製備的質粒DNA模板也可進行反應。(3)反應產物的比活性較高,可達4×109 cpm/μg探針。(4)隨機引物反應還可以在低熔點瓊脂糖中直接進行。
材料:待標記的DNA片段。
設備:高速台式離心機,恆溫水浴鍋等。
試劑:
(1)隨機引物(隨機六聚體或斷裂的鮭魚精子DNA)。
(2)10×隨機標記緩衝液:900mmol/L HEPES (pH6.6); 10mmol/L MgCl2。
(3)Klenow片段。
(4)20mmol/L DTT。
(5)未標記的dNTP溶液:dGTP、dCTP和dTTP溶液,各5mmol/L。
(6)[α-32 P] dATP:比活性>3000Ci/mmol, 10μCi/μl。
(7)緩衝液A:50mmol/L Tris·Cl (pH7.5); 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA (pH8.0); 0.5% SDS。
操作步驟:
(1) 200ng雙鏈DNA(1μl)和7.5ng隨機引物(1μl)混合後置於eppendorf管內,水浴煮沸5分鐘后,立即置於冰浴中1分鐘。
(2) 與此同時,儘快在一置於冰浴中的0.5ml eppendorf管內混合下列化合物:
20mmol/L DTT 1μl
未標記的dNTP溶液 1μl
10×隨機標記緩衝液 1μl
[α-32 P] dATP(比活性>3000Ci/mmol; 10μCi/μl) 3μl
ddH2O 1μl
(3) 將步驟(1)eppendorf管中的溶液移到步驟(2)管中。
(4) 加入5單位(約1μl) Klenow片段, 充分混合,在微型離心機中以12000g離心1-2秒, 使所有溶液沉於試管底部,在室溫下保溫3-16小時。
(5) 在反應液中加入10μl緩衝液A后,將放射性標記的探針保存在-20℃下備用。同時計算放射比活性。
[注意]1、引物與模板的比例應仔細調整,當引物高於模板時,反應產物比較短,但產物的累積較多;反之,則可獲得較長片段的探針。
2、模板DNA應是線性的,如為超螺旋DNA,則標記效率不足50%。
末端標記DNA探針
現以Klenow片段標記3'末端為例說明末端標記的方法。
1、材料:待標記的雙鏈含凹缺3'末端的DNA。
2、設備:高速台式離心機,水浴鍋等。
3、試劑:
(1)3種不含標記的dNTP各為200mmol/L。
(2)合適的限制酶。
(3)[α-32P] dNTP:3000Ci/mmol, 10mCi/ul。
(4)Klenow片段(5U/ml)。
(5)10×末端標記緩衝液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2), 0.1mol/L MgSO4, 1mmol/L DTT, 500mg/ml BSA。
4、操作步驟:
(1)25μl反應體系中用合適的限制酶酶切1μg的DNA。
(2)按下列成分加入試劑並混勻: 已酶切的DNA 1mg (25ml) 10×末端標記緩衝液 5ml 2mmol/L 3種dNTP 1ml [a-32P]-dNTP 適量 加水至 50ml
(3)加入1單位的Klenow片段,室溫下反應30分鐘。
(4)加入1ml 2mmol/L 第四種核苷酸溶液, 室溫保溫15分鐘。
(5)70℃加熱5分鐘,終止反應。
(6)用酚/氯仿抽提后,用乙醇沉澱來分離標記的DNA,或用Sephdadex G-50柱層析分離標記的DNA。
[注意]
1、利用本方法可對DNA分子量標準進行標記,利用它可定位因片段太小而無法在凝膠中觀察的DNA片段。
2、對DNA的純度不很嚴格,少量製備的質粒也可進行末端標記合成探針。
3、末端標記還有其他的一些方法,如利用T4多核苷酸激酶標記脫磷的5'端突出的DNA和平末端凹缺DNA分子,也可利用該酶進行交換反應標記5'末端。
RNA探針
許多載體如pBluescript, pGEM等均帶有來自噬菌體SP6或E.coli噬菌體T7或T3的啟動子,它們能特異性地被各自噬菌體編碼的依賴於DNA的RNA聚合酶所識別,合成特異性的RNA。在反應體系中若加入經標記的NTP,則可合成RNA探針。RNA探針一般都是單鏈,它具有單鏈DNA探針的優點,又具有許多DNA單鏈探針所沒有的優點,主要是: RNA:DNA雜交體比DNA:DNA雜交體有更高的穩定性,所以在雜交反應中RNA探針比相同比活性的DNA探針所產生信號要強。 RNA:RNA雜交體用RNA酶A酶切比S1酶切DNA:RNA雜交體容易控制,所以用RNA探針進行RNA結構分析比用DNA探針效果好。
噬菌體依賴DNA的RNA聚合酶所需的rNTP濃度比Klenow片段所需的dNTP濃度低,因而能在較低濃度放射性底物的存在下,合成高比活性的全長探針。 用來合成RNA的模板能轉錄許多次,所以RNA的產量比單鏈DNA高。並且用來合成RNA的模板能轉錄多次,可獲得比單鏈DNA更高產量的RNA。
反應完畢后,用無RNA酶的DNA酶Ⅰ處理,即可除去模板DNA,而單鏈DNA探針則需通過凝膠電泳純化才能與模板DNA分離。
另外噬菌體依賴於DNA的RNA聚合酶不識別克隆DNA序列中的細菌、質粒或真核生物的啟動子,對模板的要求也不高,故在異常位點起始RNA合成的比率很低。因此,當將線性質粒和相應的依賴DNA的RNA聚合酶及四種rNTP一起保溫時,所有RNA的合成,都由這些噬菌體啟動子起始。而在單鏈DNA探針合成中,若模板中混雜其他DNA片段,則會產生干擾。但它也存在著不可避免的缺點,因為合成的探針是RNA,它對RNase特別敏感,應而所用的器皿試劑等均應仔細地去除RNase;另外如果載體沒有很好地酶切則等量的超螺旋DNA會合成極長的RNA,它有可能帶上質粒的序列而降低特異性。

3幾種常見的雜交

分子雜交是通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上,然後用放射性標記的探針與被固定的分子雜交,經顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。根據被測定的對象,分子雜交基本可分為以下幾大類:
(1) Southern雜交:DNA片段經電泳分離后,從凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上,然後與探針雜交。被檢對象為DNA,探針為DNA或RNA。
(2) Northern雜交:RNA片段經電泳后,從凝膠中轉移到硝酸纖維素濾膜上,然後用探針雜交。被檢對象為RNA,探針為DNA或RNA。
根據雜交所用的方法,另外還有斑點(dot)雜交、狹槽(slot)雜交和菌落原位雜交等。有3種固相支持體可用於雜交:硝酸纖維素濾膜、尼龍膜和Whatman 541濾紙。不同商標的尼龍膜需要進行不同的處理,在DNA固定和雜交的過程中要嚴格按生產廠家的說明書來進行。Whatman 541濾紙有很高的濕強度,最早用於篩選細菌菌落。該濾紙主要用於篩選一些基因文庫。固定化DNA的雜交條件基本與使用硝酸纖維素濾膜時所建立的條件相同。Whatman 541濾紙與硝酸纖維素濾膜相比有一些優點:它更便宜,雜交中更耐用,乾燥過程中不易變形和碎裂等。然而若變性過程不小心,雜交信號的強度會明顯弱於用硝酸纖維素濾膜時所得到的信號強度。因此,常規的細菌篩選和各種雜交時仍選用硝酸纖維素濾膜作為固相支持體。
Northern雜交
Northern雜交與Southern雜交很相似。主要區別是被檢測對象為RNA,其電泳在變性條件下進行,以去除RNA中的二級結構,保證RNA完全按分子大小分離。變性電泳主要有3種:乙二醛變性電泳、甲醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。電泳后的瓊脂糖凝膠用與Southern轉移相同的方法將RNA轉移到硝酸纖維素濾膜上,然後與探針雜交。
1、材料:待檢測的RNA及製備好的探針。
2、設備:電泳儀,電泳槽,塑料盆,真空烤箱,放射自顯影盒,X-光片,雜交袋,硝酸纖維素膜或尼龍膜。
3、試劑:
(1)20×SSPE:175.3g NaCl, 88.2g檸檬酸鈉,溶於800ml水中,用10mol/LNaOH調pH至7.4,定溶到1L。
(2)其他試劑:與Southern雜交試劑類似,只是所有的試劑均應用DEPC處理。
4、操作步驟:
(1)RNA經變性電泳完畢后,可立即將乙醛醯RNA轉移至硝酸纖維素濾膜上。轉移方法與轉移DNA的方法相似。
(2)轉移完畢后 ,以6×SSC溶液於室溫浸泡此膜5分鐘,以除去瓊脂糖碎片。
(3)將該雜交膜夾於兩張濾紙中間,用真空烤箱於80℃乾燥0.5-2小時。
(4) 用下列兩種溶液之一進行預雜交,時間為1-2小時。若於42℃進行,應採用: 50%甲醯胺,5×SSPE,2×Denhardt's試劑,0.1% SDS;若於68℃進行,應採用:6×SSC,2×Denhardt's試劑,0.1% SDS,(注意:BLOTTO不能用於Northern雜交)。
(5) 在預雜交液中加入變性的放射性標記探針,如欲檢測低丰度mRNA,所用探針的量至少為0.1μg,其放射性比活度應大於2×108 cpm/分·μg,放在適宜的溫度條件下雜交16-24小時。
(6) 用1×SSC、0.1% SDS於室溫洗膜20分鐘,隨後用0.2×SSC、0.1% SDS於68℃洗膜3次,每次20分鐘。
(7) 用X光片(Kodak XAR-2或與之相當的產品)進行放射自顯影,附加增感屏於-70℃曝光24-48小時。
[注意]
(1)如果瓊脂糖濃度高於1%,或凝膠厚度大於0.5cm,或待分析的RNA大於2.5kb,需用0.05mol/LNaOH浸泡凝膠20分鐘,部分水解RNA並提高轉移效率。浸泡後用經DEPC處理的水淋洗凝膠,並用20×SSC浸泡凝膠45分鐘。然後再轉移到濾膜上。
(2)在步驟(3)的操作中,如果濾膜上含有乙醛醯RNA,雜交前需用20mmol/L Tris·Cl (pH8.0)於65℃洗膜,以除去RNA上的乙二醛分子。
(3)RNA自凝膠轉移至尼龍膜所用方法,與RNA轉移至硝酸纖維素濾膜所用方法類似。
(4)含甲醛的凝膠在RNA轉移前需用經DEPC處理的水淋洗數次,以除去甲醛。當使用尼龍膜雜交時注意,有些帶正電荷的尼龍膜在鹼性溶液中具有固著核酸的能力,需用7.5mmol/LNaOH溶液洗脫瓊脂糖中的乙醛醯RNA,同時可部分水解RNA,並提高較長RNA分子(>2.3kb)轉移的速度和效率。此外,鹼可以除去mRNA分子的乙二醛加合物,免去固定后洗脫的步驟。乙醛醯RNA在鹼性條件下轉移至帶正電荷尼龍膜的操作也按DNA轉移的方法進行,但轉移緩衝液為7.5mmol/LNaOH,轉移結束后(4.5-6.0小時),尼龍膜需用2×SSC、0.1%SDS淋洗片刻、於室溫晾乾。
(5)尼龍膜的不足之處是背景較高,用RNA探針時尤為嚴重。將濾膜長時間置於高濃度的鹼性溶液中,會導致雜交背景明顯升高,可通過提高預雜交和雜交步驟中有關阻斷試劑的量來予以解決。
(6)如用中性緩衝液進行RNA轉移,轉移結束后,將晾乾的尼龍膜夾在兩張濾紙中間,80℃干烤0.5-2小時,或者254nm波長的紫外線照射尼龍膜帶RNA的一面。后一種方法較為繁瑣,但卻優先使用,因為某些批號的帶正電荷的尼龍膜經此處理后,雜交信號可以增強。然而為獲得最佳效果,務必確保尼龍膜不被過度照射,適度照射可促進RNA上小部分鹼基與尼龍膜表面帶正電荷的胺基形成交聯結構,而過度照射卻使RNA上一部分胸腺嘧啶共價結合於尼龍膜表面,導致雜交信號減弱。
斑點雜交
斑點雜交是指將DNA或RNA樣品直接點在硝酸纖維素濾膜上,然後與核酸探針分子雜交,以顯示樣品中是否存在特異的DNA或RNA。同一種樣品經不同倍數的稀釋,還可以得到半定量的結果。所以它是一種簡便、快速、經濟的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因診斷中經常用到,是研究基因表達的有力工具。但由於目的序列未與非目的序列分離,不能了解目的序列的長度。尤其當本底干擾較高時,難以區分目的序列信號和干擾信號。
1、材料:待分析的DNA或RNA樣品,已標記的探針。
2、設備:狹槽點樣器,真空泵,恆溫水浴,真空烤箱等。
3、試劑:
(1)100% 甲醯胺。
(2)甲醛(37%)。
(3) 20×SSC。
(4)0.1mol/L NaOH。
(5)硝酸纖維素濾膜。
(6)濾紙。
4、操作步驟:
(1) 10μl樣品與20μl 100%甲醯胺、 7μl 37%甲醛、2μl 20×SSC混合。混合置於68℃,15分鐘後置冰浴中。
(2) 用0.1mol/L NaOH清洗點樣器,再用無菌水充分沖洗。將一張經20×SSC浸潤的濾紙鋪在點樣器上,上面再鋪上一張經20×SSC浸潤1小時的硝酸纖維素濾膜,加蓋並夾緊,接通真空泵。
(3) 用10×SSC清洗各樣孔。在每一樣品中加兩倍體積的2×SSC,混合后加樣於孔中。外圍幾個孔中加2μl染料定位,緩慢抽吸。每孔用1ml 10×SSC清洗兩次。繼續抽吸5分鐘,吸干濾膜。
(4) 取出濾膜,夾在兩張濾紙中間, 80℃真空烘乾2小時。按上述Southern或Norhtern雜交所述的方法與放射性標記探針雜交。
[注意]
1、在放射自顯影時應注意濾膜必須乾燥,並覆蓋上保鮮膜,否則,濾膜將與X-光片粘在一起,使以後的操作困難。
2、在雜交過程中,整個濾膜應一直是濕潤的,不得乾涸。
第三節 雜交反應的條件及參數的優化
不同的反應條件對雜交結果的影響如下:
(1) 根據雜交液的體積確定雜交的時間:一般來說使用較小體積的雜交液比較好,因為在小體積溶液中,核酸重新配對的速度快、探針用量少,從而使濾膜上的DNA在反應中起主要作用。但在雜交中必須保證有足夠的雜交溶液覆蓋雜交膜。
(2) 根據所用的雜交溶液確定雜交的溫度:一般來說,雜交相為水溶液時,則在68℃雜交,而在50%甲醯胺溶液中時,則在42℃下雜交。
(3) 選用不同的封閉試劑:如Denhardt's試劑、肝素或一種由5%脫脂奶粉組成的BLOTTO, 這些試劑中需加入斷裂的鮭魚精子DNA或酵母DNA,並和SDS一起使用。與Denhardt's試劑相比, BLOTTO價格便宜,使用方便,同樣可獲得滿意的結果,但它不能用於RNA雜交。一般而言,尼龍膜用Denhardt's試劑比用BLOTTO能得到更高的信噪比。對硝酸纖維素濾膜而言,通常在預雜交溶液和雜交溶液中都含有封閉劑。但是對尼龍膜,經常從雜交溶液中省去封閉劑,因為高濃度的蛋白質會幹擾探針和目的基因的退火。
(4)根據需要在雜交過程中選用不同的振蕩方法和程度,許多雜交膜一起反應時,連續的輕微振蕩可獲得較好的雜交結果。
(5) 在雜交過程中加入其他化合物, 如反應體系中加入10%硫酸葡聚糖或10% PEG, 雜交速度可增加約10倍。檢測稀有序列時常用該方法,但它們有時會導致本底較高,並由於溶液的粘稠性而使操作困難。因此,除非在濾膜上含有的目的DNA量很少,或放射性探針的量有限, 一般不用硫酸葡聚糖或PEG。
(6) 根據探針與被檢測目標之間的同源程度選擇清洗的程度,如具有很高的同源性可選用嚴緊型洗脫方式(高濃度SSC), 反之則選用非嚴緊型洗脫方式(低濃度SSC)。洗脫通常在低於雜交體解鏈溫度12-20℃的條件下進行。解鏈溫度(melting temperature, Tm )是指在雙鏈DNA或RNA分子變性形成分開的單鏈時光吸收度增加的中點處溫度。通常富含G·C鹼基對的序列比富含A·T鹼基對序列的Tm 溫度高。有關Tm的計算方法,請參考第八章。
(7) 根據標記探針的濃度及其比活性,選擇不同的雜交條件及檢測方法。一般使用新的同位素可獲得較強的信號。
(8) 在水溶液中雜交時,用6×SSC或6×SSPE溶液的效果都一樣。但在甲醯胺溶液中雜交時,應該用具有更強緩衝能力的6×SSPE。
上述這些條件的改變,對雜交的結果有不同的影響,應根據研究的具體情況,選用適當的方法。
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