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分級梯度洗脫

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梯度洗脫(gradient elution)又稱為梯度淋洗或程序洗脫。在同一個分析周期中,按一定程度不斷改變流動相的濃度配比,稱為梯度洗脫。分級梯度洗脫是依據各種離子或離子化合物與離子交換劑的結合力不同而進行分離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑,它是由一類不溶於水的惰性高分子聚合物基質通過一定的化學反應共價結合上某種電荷基團形成的。

1 分級梯度洗脫 -簡介

  梯度洗脫(gradientelution)又稱為梯度淋洗或程序洗脫。在同一個分析周期中,按一定程度不斷改變流動相的濃度配比,稱為梯度洗脫。分級梯度洗脫是依據各種離子或離子化合物與離子交換劑的結合力不同而進行分離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑,它是由一類不溶於水的惰性高分子聚合物基質通過一定的化學反應共價結合上某種電荷基團形成的。

2 分級梯度洗脫 -原理

  分級梯度洗脫是依據各種離子或離子化合物與離子交換劑的結合力不同而進行分離純化的。離子交換層析的固定相是離子交換劑,它是由一類不溶於水的惰性高分子聚合物基質通過一定的化學反應共價結合上某種電荷基團形成的。離子交換劑可以分為三部分:高分子聚合物基質、電荷基團和平衡離子。電荷基團與高分子聚合物共價結合,形成一個帶電的可進行離子交換的基團。平衡離子是結合於電荷基團上的相反離子,它能與溶液中其它的離子基團發生可逆的交換反應。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團發生交換作用,稱為陽離子交換劑;平衡離子帶負電的離子交換劑與帶負電的離子基團發生交換作用,稱為陰離子交換劑。
  其中R代表離子交換劑的高分子聚合物基質,X?和X?分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑中與高分子聚合物共價結合的電荷基團,Y?和Y?分別代表陽離子交換劑和陰離子交換劑的平衡離子,A?和A?分別代表溶液中的離子基團。
  從上面的反應式中可以看出,如果A離子與離子交換劑的結合力強於Y離子,或者提高A離子的濃度,或者通過改變其它一些條件,可以使A離子將Y離子從離子交換劑上置換出來。也就是說,在一定條件下,溶液中的某種離子基團可以把平衡離子置換出來,並通過電荷基團結合到固定相上,而平衡離子則進入流動相,這就是離子交換層析的基本置換反應。通過在不同條件下的多次置換反應,就可以對溶液中不同的離子基團進行分離。下面以陰離子交換劑為例簡單介紹離子交換層析的基本分離過程。
  陰離子交換劑的電荷基團帶正電,裝柱平衡后,與緩衝溶液中的帶負電的平衡離子結合。待分離溶液中可能有正電基團、負電基團和中性基團。加樣后,負電基團可以與平衡離子進行可逆的置換反應,而結合到離子交換劑上。而正電基團和中性基團則不能與離子交換劑結合,隨流動相流出而被去除。通過選擇合適的洗脫方式和洗脫液,如增加離子強度的梯度洗脫。隨著洗脫液離子強度的增加,洗脫液中的離子可以逐步與結合在離子交換劑上的各種負電基團進行交換,而將各種負電基團置換出來,隨洗脫液流出。與離子交換劑結合力小的負電基團先被置換出來,而與離子交換劑結合力強的需要較高的離子強度才能被置換出來,這樣各種負電基團就會按其與離子交換劑結合力從小到大的順序逐步被洗脫下來,從而達到分離目的。
  各種離子與離子交換劑上的電荷基團的結合是由靜電力產生的,是一個可逆的過程。結合的強度與很多因素有關,包括離子交換劑的性質、離子本身的性質、離子強度、pH、溫度、溶劑組成等等。離子交換層析就是利用各種離子本身與離子交換劑結合力的差異,並通過改變離子強度、pH等條件改變各種離子與離子交換劑的結合力而達到分離的目的。離子交換劑的電荷基團對不同的離子有不同的結合力。一般來講,離子價數越高,結合力越大;價數相同時,原子序數越高,結合力越大。如陽離子交換劑對離子的結合力順序為:Li?pH的蛋白帶正電,能與陽離子交換劑結合,一般pI越大的蛋白與離子交換劑結合力越強。但由於生物樣品的複雜性以及其它因素影響,一般生物大分子與離子交換劑的結合情況較難估計,往往要通過實驗進行摸索。
  離子交換劑的大分子聚合物基質可以由多種材料製成,聚苯乙烯離子交換劑(又稱為聚苯乙烯樹脂)是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔網狀結構的聚苯乙烯為基質。聚苯乙烯離子交換劑機械強度大、流速快。但它與水的親和力較小,具有較強的疏水性,容易引起蛋白的變性。故一般常用於分離小分子物質,如無機離子、氨基酸、核苷酸等。以纖維素(Cellulose)、球狀纖維素(Sephacel)、葡聚糖(Sephadex)、瓊脂糖(Sepharose)為基質的離子交換劑都與水有較強的親和力,適合於分離蛋白質等大分子物質,葡聚糖離子交換劑一般以SephadexG-25和G-50為基質,瓊脂糖離子交換劑一般以SepharoseCL-6B為基質。關於這些離子交換劑的性質可以參閱相應的產品介紹。

3 分級梯度洗脫 -電荷基團

  根據與基質共價結合的電荷基團的性質,可以將離子交換劑分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。
  陽離子交換劑的電荷基團帶負電,可以交換陽離子物質。根據電荷基團的解離度不同,又可以分為強酸型、中等酸型和弱酸型三類。它們的區別在於它們電荷基團完全解離的pH範圍,強酸型離子交換劑在較大的pH範圍內電荷基團完全解離,而弱酸型完全解離的pH範圍則較小,如羧甲基在pH小於6時就失去了交換能力。一般結合磺酸基團(?SO3H),如磺酸甲基(簡寫為SM)、磺酸乙基(SE)等為強酸型離子交換劑,結合磷酸基團(?PO3H2)和亞磷酸基團(?PO2H)為中等酸型離子交換劑,結合酚羥基(?OH)或羧基(?COOH),如羧甲基(CM)為弱酸型離子交換劑。一般來講強酸型離子交換劑對H離子的結合力比Na+離子小,弱酸型離子交換劑對H離子的結合力比Na+離子大。

4 分級梯度洗脫 -交換容量

  交換容量是指離子交換劑能提供交換離子的量,它反映離子交換劑與溶液中離子進行交換的能力。通常所說的離子交換劑的交換容量是指離子交換劑所能提供交換離子的總量,又稱為總交換容量,它只和離子交換劑本身的性質有關。在實際實驗中關心的是層析柱與樣品中各個待分離組分進行交換時的交換容量,它不僅與所用的離子交換劑有關,還與實驗條件有很大的關係,一般又稱為有效交換容量。後面提到的交換容量如未經說明都是指有效交換容量。
  影響交換容量的因素很多,主要可以分為兩個方面,一方面是離子交換劑顆粒大小、顆粒內孔隙大小以及所分離的樣品組分的大小等的影響。這些因素主要影響離子交換劑中能與樣品組分進行作用的有效表面積。樣品組分與離子交換劑作用的表面積越大當然交換容量越高。一般離子交換劑的孔隙應盡量能夠讓樣品組分進入,這樣樣品組分與離子交換劑作用面積大。分離小分子樣品,可以選擇較小孔隙的交換劑,因為小分子可以自由的進入孔隙,而小孔隙離子交換劑的表面積大於大孔隙的離子交換劑。對於較大分子樣品,可以選擇小顆粒交換劑,因為對於很大的分子,一般不能進入孔隙內部,交換隻限於顆粒表面,而小顆粒的離子交換劑表面積大。
  另一些影響因素如實驗中的離子強度、pH值等主要影響樣品中組分和離子交換劑的帶電性質。一般pH對弱酸和弱鹼型離子交換劑影響較大,如對於弱酸型離子交換劑在pH較高時,電荷基團充分解離,交換容量大,而在較低的pH時,電荷基團不易解離,交換容量小。同時pH也影響樣品組分的帶電性。尤其對於蛋白質等兩性物質,在離子交換層析中要選擇合適的pH以使樣品組分能充分的與離子交換劑交換、結合。一般來說,離子強度增大,交換容量下降。實驗中增大離子強度進行洗脫,就是要降低交換容量以將結合在離子交換劑上的樣品組分洗脫下來。
  離子交換劑的總交換容量通常以每毫克或每毫升交換劑含有可解離基團的毫克當量數(MEQ/mg或meq/ml)來表示。通常可以由滴定法測定。陽離子交換劑首先用HCl處理,使其平衡離子為H?。再用水洗至中性,對於強酸型離子交換劑,用NaCl充分置換出H?,再用標準濃度的NaOH滴定生成的HCl,就可以計算出離子交換劑的交換容量;對於弱酸型離子交換劑,用一定量的鹼將H?充分置換出來,再用酸滴定,計算出離子交換劑消耗的鹼量,就可以算出交換容量。陰離子交換劑的交換容量也可以用類似的方法測定。
  對於一些常用於蛋白質分離的離子交換劑也通常用每毫克或每毫升交換劑能夠吸附某種蛋白質的量來表示,一般這種表示方法對於分離蛋白質等生物大分子具有更大的參考價值。實驗前可以參閱相應的產品介紹了解各種離子交換劑的交換容量。
  離子交換劑的種類很多,離子交換層析要取得較好的效果首先要選擇合適的離子交換劑。
  首先是對離子交換劑電荷基團的選擇,確定是選擇陽離子交換劑還是選擇陰離子交換劑。這要取決於被分離的物質在其穩定的pH下所帶的電荷,如果帶正電,則選擇陽離子交換劑;如帶負電,則選擇陰離子交換劑。例如待分離的蛋白等電點為4,穩定的pH範圍為6-9,由於這時蛋白帶負電,故應選擇陰離子交換劑進行分離。強酸或強鹼型離子交換劑適用的pH範圍廣,常用於分離一些小分子物質或在極端pH下的分離。由於弱酸型或弱鹼型離子交換劑不易使蛋白質失活,故一般分離蛋白質等大分子物質常用弱酸型或弱鹼型離子交換劑。
  其次是對離子交換劑基質的選擇。前面已經介紹了,聚苯乙烯離子交換劑等疏水性較強的離子交換劑一般常用於分離小分子物質,如無機離子、氨基酸、核苷酸等。而纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等離子交換劑親水性較強,適合於分離蛋白質等大分子物質。一般纖維素離子交換劑價格較低,但解析度和穩定性都較低,適於初步分離和大量製備。葡聚糖離子交換劑的解析度和價格適中,但受外界影響較大,體積可能隨離子強度和pH變化有較大改變,影響解析度。瓊脂糖離子交換劑機械穩定性較好,解析度也較高,但價格較貴。
  另外離子交換劑顆粒大小也會影響分離的效果。離子交換劑顆粒一般呈球形,顆粒的大小通常以目數(mesh)或者顆粒直徑(?m)來表示,目數越大表示直徑越小。前面在介紹交換容量時提到了一些關於交換劑顆粒大小、孔隙的選擇。另外離子交換層析柱的解析度和流速也都與所用的離子交換劑顆粒大小有關。一般來說顆粒小,解析度高,但平衡離子的平衡時間長,流速慢;顆粒大則相反。所以大顆粒的離子交換劑適合於對解析度要求不高的大規模製備性分離,而小顆粒的離子交換劑適於需要高解析度的分析或分離。
  這裡特別要提到的是,離子交換纖維素目前種類很多,其中以DEAE-纖維素(二乙基氨基纖維素)和CM-纖維素(羧甲基纖維素)最常用,它們在生物大分子物質(蛋白質,酶,核酸等)的分離方面顯示很大的優越性。一是它具有開放性長鏈和鬆散的網狀結構,有較大的表面積,大分子可自由通過,使它的實際交換容量要比離子交換樹脂大的多;二是它具有親水性,對蛋白質等生物大分子物質吸附的不太牢,用較溫和的洗脫條件就可達到分離的目的,因此不致引起生物大分子物質的變性和失活。三是它的回收率高。所以離子交換纖維素已成為非常重要的一類離子交換劑。
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