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原子力顯微鏡

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原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope ,AFM),一種可用來研究包括絕緣體在內的固體材料表面結構的分析儀器。它通過檢測待測樣品表面和一個微型力敏感元件之間的極微弱的原子間相互作用力來研究物質的表面結構及性質。將一對微弱力極端敏感的微懸臂一端固定,另一端的微小針尖接近樣品,這時它將與其相互作用,作用力將使得微懸臂發生形變或運動狀態發生變化。掃描樣品時,利用感測器檢測這些變化,就可獲得作用力分佈信息,從而以納米級解析度獲得表面結構信息。

1簡介

生物型原子力顯微鏡

  生物型原子力顯微鏡

它主要由帶針尖的微懸臂、微懸臂運動檢測裝置、監控其運動的反饋迴路、使樣品進行掃描的壓電陶瓷掃描器件、計算機控制的圖像採集、顯示及處理系統組成。微懸臂運動可用如隧道電流檢測等電學方法或光束偏轉法、干涉法等光學方法檢測,當針尖與樣品充分接近相互之間存在短程相互斥力時,檢測該斥力可獲得表面原子級分辨圖像,一般情況下解析度也在納米級水平。AFM測量對樣品無特殊要求,可測量固體表面、吸附體系等。

2原理

詳細
圖1. 激光檢測原子力顯微鏡探針工作示意圖

  圖1. 激光檢測原子力顯微鏡探針工作示意圖

原子力顯微鏡的基本原理是:將一個對微弱力極敏感的微懸臂一端固定,另一端有一微小的針尖,針尖與樣品表面輕輕接觸,由於針尖尖端原子與樣品表面原子間存在極微弱的排斥力,通過在掃描時控制這種力的恆定,帶有針尖的微懸臂將對應於針尖與樣品表面原子間作用力的等位面而在垂直於樣品的表面方向起伏運動。利用光學檢測法或隧道電流檢測法,可測得微懸臂對應於掃描各點的位置變化,從而可以獲得樣品表面形貌的信息。下面,我們以激光檢測原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope Employing Laser Beam Deflection for Force Detection,Laser-AFM)——掃描探針顯微鏡家族中最常用的一種為例,來詳細說明其工作原理。
如圖1所示,二極體激光器(Laser Diode)發出的激光束經過光學系統聚焦在微懸臂(Cantilever)背面,並從微懸臂背面反射到由光電二極體構成的光斑位置檢測器(Detector)。在樣品掃描時,由於樣品表面的原子與微懸臂探針尖端的原子間的相互作用力,微懸臂將隨樣品表面形貌而彎曲起伏,反射光束也將隨之偏移,因而,通過光電二極體檢測光斑位置的變化,就能獲得被測樣品表面形貌的信息。
子力顯微鏡——原理圖

  子力顯微鏡——原理圖

在系統檢測成像全過程中,探針和被測樣品間的距離始終保持在納米(10e-9米)量級,距離太大不能獲得樣品表面的信息,距離太小會損傷探針和被測樣品,反饋迴路(Feedback)的作用就是在工作過程中,由探針得到探針-樣品相互作用的強度,來改變加在樣品掃描器垂直方向的電壓,從而使樣品伸縮,調節探針和被測樣品間的距離,反過來控制探針-樣品相互作用的強度,實現反饋控制。因此,反饋控制是本系統的核心工作機制。本系統採用數字反饋控制迴路,用戶在控制軟體的參數工具欄通過以參考電流、積分增益和比例增益幾個參數的設置來對該反饋迴路的特性進行控制。

3優缺點

缺點
和掃描電子顯微鏡(SEM)相比,AFM的缺點在於成像範圍太小,速度慢,受探頭的影響太大。原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope)是繼掃描隧道顯微鏡(Scanning Tunneling Microscope)之後發明的一種具有原子級高分辨的新型儀器,可以在大氣和液體環境下對各種材料和樣品進行納米區域的物理性質包括形貌進行探測,或者直接進行納米操縱;現已廣泛應用於半導體、納米功能材料、生物、化工、食品、醫藥研究和科研院所各種納米相關學科的研究實驗等領域中,成為納米科學研究的基本工具。原子力顯微鏡與掃描隧道顯微鏡相比,由於能觀測非導電樣品,因此具有更為廣泛的適用性。當前在科學研究和工業界廣泛使用的掃描力顯微鏡(Scanning Force Microscope),其基礎就是原子力顯微鏡。

4儀器結構

在原子力顯微鏡(Atomic Force Microscopy,AFM)的系統中,可分成三個部分:力檢測部分、位置檢測部分、反饋系統。
位置檢測部分
原子力顯微鏡

  原子力顯微鏡

在原子力顯微鏡(AFM)的系統中,當針尖與樣品之間有了交互作用之後,會使得懸臂cantilever擺動,所以當激光照射在微懸臂的末端時,其反射光的位置也會因為懸臂擺動而有所改變,這就造成偏移量的產生。在整個系統中是依靠激光光斑位置檢測器將偏移量記錄下並轉換成電的信號,以供SPM控制器作信號處理。
總結
AFM系統使用壓電陶瓷管製作的掃描器精確控制微小的掃描移動。壓電陶瓷是一種性能奇特的材料,當在壓電陶瓷對稱的兩個端面加上電壓時,壓電陶瓷會按特定的方向伸長或縮短。而伸長或縮短的尺寸與所加的電壓的大小成線性關係。也就是說,可以通過改變電壓來控制壓電陶瓷的微小伸縮。通常把三個分別代表X,Y,Z方向的壓電陶瓷塊組成三角架的形狀,通過控制X,Y方向伸縮達到驅動探針在樣品表面掃描的目的;通過控制Z方向壓電陶瓷的伸縮達到控制探針與樣品之間距離的目的。
原子力顯微鏡(AFM)便是結合以上三個部分來將樣品的表面特性呈現出來的:在原子力顯微鏡(AFM)的系統中,使用微小懸臂(cantilever)來感測針尖與樣品之間的相互作用,這作用力會使微懸臂擺動,再利用激光將光照射在懸臂的末端,當擺動形成時,會使反射光的位置改變而造成偏移量,此時激光檢測器會記錄此偏移量,也會把此時的信號給反饋系統,以利於系統做適當的調整,最後再將樣品的表面特性以影像的方式給呈現出來。

5工作模式

原子力顯微鏡的工作模式是以針尖與樣品之間的作用力的形式來分類的。主要有以下3種操作模式:接觸模式(contact mode) ,非接觸模式( non - contact mode) 和敲擊模式( tapping mode)。
非接觸模式
非接觸模式探測試樣表面時懸臂在距離試樣表面上方5~10 nm 的距離處振蕩。這時,樣品與針尖之間的相互作用由范德華力控制,通常為10 - 12 N ,樣品不會被破壞,而且針尖也不會被污染,特別適合於研究柔嫩物體的表面。這種操作模式的不利之處在於要在室溫大氣環境下實現這種模式十分困難。因為樣品表面不可避免地會積聚薄薄的一層水,它會在樣品與針尖之間搭起一小小的毛細橋,將針尖與表面吸在一起,從而增加尖端對錶面的壓力。
三種模式的比較
接觸模式(Contact Mode):
優點:掃描速度快,是唯一能夠獲得「原子解析度」圖像的AFM垂直方向上有明顯變化的質硬樣品,有時更適於用Contact Mode掃描成像。
缺點:橫向力影響圖像質量。在空氣中,因為樣品表面吸附液層的毛細作用,使針尖與樣品之間的粘著力很大。橫向力與粘著力的合力導致圖像空間解析度降低,而且針尖刮擦樣品會損壞軟質樣品(如生物樣品,聚合體等)。
非接觸模式(Non-Contact Mode):
優點:沒有力作用於樣品表面。
缺點:由於針尖與樣品分離,橫向解析度低;為了避免接觸吸附層而導致針尖膠粘,其掃描速度低於Tapping Mode和Contact Mode AFM。通常僅用於非常怕水的樣品,吸附液層必須薄,如果太厚,針尖會陷入液層,引起反饋不穩,刮擦樣品。由於上述缺點,on-contact Mode的使用受到限制。
輕敲模式(Tapping Mode):
優點:很好的消除了橫向力的影響。降低了由吸附液層引起的力,圖像解析度高,適於觀測軟、易碎、或膠粘性樣品,不會損傷其表面。
缺點:比Contact Mode AFM 的掃描速度慢。

其他模式

除了上面三種常見的三種工作模式外,原子力顯微鏡還可以進行下面的工作:
1、橫向力顯微鏡(LFM)
橫向力顯微鏡(LFM)是在原子力顯微鏡(AFM)表面形貌成像基礎上發展的新技術之一。工作原理與接觸模式的原子力顯微鏡相似。當微懸臂在樣品上方掃描時,由於針尖與樣品表面的相互作用,導致懸臂擺動,其擺動的方向大致有兩個:垂直與水平方向。一般來說,激光位置探測器所探測到的垂直方向的變化,反映的是樣品表面的形態,而在水平方向上所探測到的信號的變化,由於物質表面材料特性的不同,其摩擦係數也不同,所以在掃描的過程中,導致微懸臂左右扭曲的程度也不同,檢測器根據激光束在四個象限中,(A+C)-(B+D)這個強度差值來檢測微懸臂的扭轉彎曲程度。而微懸臂的扭轉彎曲程度隨表面摩擦特性變化而增減(增加摩擦力導致更大的扭轉)。激光檢測器的四個象限可以實時分別測量並記錄形貌和橫向力數據。
2、曲線測量
SFM除了形貌測量之外,還能測量力對探針-樣品間距離的關係曲線Zt(Zs)。它幾乎包含了所有關於樣品和針尖間相互作用的必要信息。當微懸臂固定端被垂直接近,然後離開樣品表面時,微懸臂和樣品間產生了相對移動。而在這個過程中微懸臂自由端的探針也在接近、甚至壓入樣品表面,然後脫離,此時原子力顯微鏡(AFM)測量並記錄了探針所感受的力,從而得到力曲線。Zs是樣品的移動,Zt是微懸臂的移動。這兩個移動近似於垂直於樣品表面。用懸臂彈性係數c乘以Zt,可以得到力F=c·Zt。如果忽略樣品和針尖彈性變形,可以通過s=Zt-Zs給出針尖和樣品間相互作用距離s。這樣能從Zt(Zs)曲線決定出力-距離關係F(s)。這個技術可以用來測量探針尖和樣品表面間的排斥力或長程吸引力,揭示定域的化學和機械性質,像粘附力和彈力,甚至吸附分子層的厚度。如果將探針用特定分子或基團修飾,利用力曲線分析技術就能夠給出特異結合分子間的力或鍵的強度,其中也包括特定分子間的膠體力以及疏水力、長程引力等。
3、納米加工
掃描探針納米加工技術是納米科技的核心技術之一,其基本的原理是利用SPM的探針-樣品納米可控定位和運動及其相互作用對樣品進行納米加工操縱,常用的納米加工技術包括:機械刻蝕、電致/場致刻蝕、浸潤筆(Dip-Pen Nano-lithography,DNP)等。

6樣品的要求

原子力顯微鏡研究對象可以是有機固體、聚合物以及生物大分子等,樣品的載體選擇範圍很大,包括雲母片、玻璃片、石墨、拋光矽片、二氧化硅和某些生物膜等,其中最常用的是新剝離的雲母片,主要原因是其非常平整且容易處理。而拋光矽片最好要用濃硫酸與30%雙氧水的7∶3 混合液在90 ℃下煮1h。利用電性能測試時需要導電性能良好的載體,如石墨或鍍有金屬的基片。
試樣的厚度,包括試樣台的厚度,最大為10 mm。如果試樣過重,有時會影響Scanner的動作,請不要放過重的試樣。試樣的大小以不大於試樣台的大小(直徑20 mm)為大致的標準。稍微大一點也沒問題。但是,最大值約為40 mm。如果未固定好就進行測量可能產生移位。請固定好后再測定。

7應用

隨著科學技術的發展,生命科學開始向定量科學方向發展。大部分實驗的研究重點已經變成生物大分子,特別是核酸和蛋白質的結構及其相關功能的關係。因為AFM的工作範圍很寬,可以在自然狀態(空氣或者液體)下對生物醫學樣品直接進行成像,解析度也很高。因此,AFM已成為研究生物醫學樣品和生物大分子的重要工具之一。AFM應用主要包括三個方面:生物細胞的表面形態觀測;生物大分子的結構及其他性質的觀測研究;生物分子之間力譜曲線的觀測。
AFM對生物細胞的表面形態觀察
AFM可以用來對細胞進行形態學觀察,並進行圖像的分析。通過觀察細胞表面形態和三維結構,可以獲得細胞的表面積、厚度、寬度和體積等的量化參數等。例如,利用AFM可以對感染病毒后的細胞表面形態的改變、造骨細胞在加入底物(鈷鉻、鈦、鈦釩等)后細胞形態和細胞彈性的變化、GTP對胰腺外分泌細胞囊泡高度的影響進行研究。利用AFM還可以對自由基損傷的紅細胞膜表面精細結構的研究,直接觀察到自由基損傷,以及加女貞子保護作用后,對紅細胞膜分子形態學的影響。
生物大分子的結構及其他性質的觀測研究
2.1 蛋白質
對於蛋白質,AFM的出現極大的推動了其研究進展。AFM可以觀察一些常見的蛋白質,諸如白蛋白,血紅蛋白,胰島素及分子馬達和噬菌調理素吸附在圖同固體界面上的行為,對於了解生物相溶性,體外細胞的生長,蛋白質的純化,膜中毒有很大幫助。例如,Dufrene 等利用AFM 考察了吸附在高分子支撐材料表面上的膠原蛋白的組裝行為。結合X-射線光電子能譜技術和輻射標記技術,他們提出了一個定性解釋其層狀結構的幾何模型。AFM 實驗證實了膠原蛋白組裝有時連續,有時不連續的性質,通過形貌圖也提供了膠原蛋白纖維狀結構特徵。Quist等利用AFM 研究了白蛋白和豬胰島素在雲母基底上的吸附行為,根據AFM 圖上不同尺寸的小丘狀物質推測,蛋白質有時發生聚集,有時分散分佈。Epand 等則利用AFM 技術研究了一類感冒病毒的紅血球凝集素,首次展示了一種膜溶原蛋白自組裝形成病毒摺疊蛋白分子外域的實時過程。
在AFM 觀察包裹有紫膜的噬菌調理素蛋白(BR) 的研究中,AFM 儀器的改進,檢測技術的提高和制樣技術的完善得到了集中的體現。在細胞中,分子馬達可以將化學能轉變為機械運動,防止因為布朗運動導致的細胞中具有方向性的活動出現錯誤,這些活動包括:肌漿球蛋白,運動蛋白,動力蛋白,螺旋酶,DNA 聚合酶和RNA 聚合酶等分子馬達蛋白的共同特點是沿著一條線性軌道執行一些與生命活動息息相關的功能,比如肌肉的收縮,細胞的分化過程中染色體的隔離,不同細胞間的細胞器的置換以及基因信息的解碼和複製等。由於分子馬達本身的微型化,它們容易受更高的熱能和大的波動的影響,了解馬達分子如何正常有序工作就成為一項具有挑戰性的任務。利用AFM,人們已經知道了肌動蛋白結合蛋白的結構信息和細胞運動過程中肌動蛋白骨架調控功能。
2.2 脫氧核糖核酸(DNA)
AFM液相成像技術的優點在於消除了毛細作用力,針尖粘滯力,更重要的是可以在接近生理條件下考察DNA 的單分子行為。DNA 分子在緩衝溶液或水溶液中與基底結合不緊密,是液相AFM面臨的主要困難之一。硅烷化試劑,如3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和陽離子磷脂雙層修飾的雲母基底固定DNA 分子,再在緩衝液中利用AFM 成像,可以解決這一難題。在氣相條件下陽離子參與DNA的沉積已經發展十分成熟,適於AFM 觀察。在液相條件下,APTES 修飾的雲母基底較常用。目前DNA的許多構象諸如彎曲,超螺旋,小環結構,三鏈螺旋結構,DNA 三通接點構象,DNA 複製和重組的中間體構象,分子開關結構和藥物分子插入到DNA 鏈中的相互作用都廣泛地被AFM考察,獲得了許多新的理解。
2.3 核糖核酸( RNA)
AFM對RNA的研究還不是很多。結晶的轉運RNA 和單鏈病毒RNA 以及寡聚Poly (A) 的單鏈RNA 分子的AFM 圖像已經被獲得。因為在於不同的緩衝條件下,單鏈RNA 的結構變化十分複雜,所以單鏈RNA 分子的圖像不容易採集。(利用AFM成像RNA分子需要對樣品進行特殊和複雜的處理。Bayburt 等借鑒Ni2 + 固定DNA 的方法在緩衝條件下獲得了單鏈Pre-m RNA 分子的AFM 圖像。他們的做法如下: (1) 用酸處理被Ni2 + 修飾的雲母基底以增加結合力; (2) RNA 分子在70℃退火,慢慢將其冷卻至室溫再滴加在用酸處理過的Ni2 +-雲母基底上。採用AFM 單分子力譜技術,在Mg2 + 存在的溶液中,Liphardt 等研究了形貌多變的RNA 分子的機械去摺疊過程,發現了從髮夾結構到三螺旋連接體這些RNA 分子三級結構的過渡態。隨後他們又利用RNA 分子證實了可逆非平衡功函和可逆平衡自由能在熱力學上的等效性。)
2.4 核酸與蛋白質複合物( Nuclearacids-Protein Complex)
DNA 和蛋白質分子的特定相互作用在分子生物學中起著關鍵作用。蛋白質與DNA 結合的精確位點圖譜和不同細胞狀態下結合位點的測定對於了解複雜細胞體系的功能與機理,特別是基因表達的控制都十分關鍵。AFM 作為一種高度分辨達0。1 nm,寬度解析度為2 nm 左右的表面分析技術,已廣泛地用於表徵各類DNA-蛋白質的複合物。低濕度大氣條件下,Rees 等利用AFM 在接觸模式下考察了λ2PL 啟動子在啟動和關閉轉錄過程中對DNA 鏈彎曲程度的影響。此外,這個小組還研究了另外一種λ2轉錄因子,Cro-蛋白對DNA 彎曲的影響。為了研究Jun 蛋白的結合是否會引起DNA 鏈的彎曲,Becker等利用AFM研究了包含一個AP21 結合位點的線性化質粒DNA 與Jun 蛋白的複合物。Aizawa小組對DNA 蛋白激酶Ku 亞結構域和雙鏈DNA斷裂的相關性進行了研究。Kasas 等研究了大腸桿菌RNA 聚合酶(RNAP) 轉錄過程中的動態酶活性。他們的方法是在Zn2 + 存在的條件下,RNAP 能夠鬆散或緊密地與DNA 模板進行結合,通過AFM 成像了解其動態過程。
2.5 細胞( Cell)
AFM 不僅能夠提供超光學極限的細胞結構圖像,還能夠探測細胞的微機械特性,利用AFM 力-曲線技術甚至能夠實時地檢測細胞動力學和細胞運動過程。利用AFM 研究細胞很少用樣品預處理,尤其是能夠在近生理條件下對它們進行研究。
利用AFM 直接成像方法,可以對固定的活細胞和亞細胞結構進行了深入研究。這些研究獲得了關於細胞器的構造,細胞膜和細胞骨架更詳細的信息。將細胞固定在基底上再進行AFM 觀察,可以得到細胞膜結構的皺褶,層狀脂肪物,微端絲和微絨毛等特徵。由於細胞質膜掩蓋了細胞內部骨架,現在已經發展了一種仔細剝離該層膜的方法,並利用AFM 對剝離細胞膜后的結構進行了研究。
AFM 在細胞研究方面的一個最重要用途是對活細胞的動力學過程,細胞間的相互作用以及細胞對其內外干擾因素的響應進行實時成像目前,AFM已經可以對外來病毒感染的細胞進行實時考察。AFM還可以研究活性狀態下血小板形狀的變化情況和培養的胰腺細胞對澱粉消化酶的響應情況。
2.6病毒( Virus)
早期,AFM 在生物學上的應用主要集中在病毒研究。Kolbe 等首次研究了具有不同頭尾結構的T4 噬菌體。Imai 及其合作者分別對煙草花葉病毒和各類噬菌體進行了考察。煙草花葉病毒( TMV) 或星形煙草花葉病毒(STMV) 是迄今研究得最多的病毒類型。在膠體溶液中,TMV非常類似已知的蛋白質行為,可以採用研究蛋白質的方法對其進行考察。利用AFM,可以研究高度過飽和和輕微過飽和條件下TMV的二維成核生長過程。AFM研究表明,當TYMV 暴露在平衡條件下的溶液中,TYMV 晶體的(101) 面逐層向上生長,晶格的結構缺陷如空位,單粒子,位錯和聚集等現象在AFM 圖上區分得十分清楚。Turner 等利用從AIDS 病毒中提取的逆轉錄酶修飾AFM橫樑,使之成為一種能檢測抑制酶的活力和篩選使AIDS 病毒失活藥物的方法。自支撐磷脂膜與感冒病毒結合作用以及缺陷位點結構上底物暴露的磷脂單層效應和水合雙層磷脂的檢測被發展成了一種新型生物感測器,這種感測器能夠從其它大分子中識別特定的病毒物質。這些結果都被AFM 圖像所證實。
生物分子間力譜曲線的觀測
對生物分子表面的各種相互作用力進行測量,是AFM的一個十分重要的功能。這對於了解生物分子的結構和物理特性是非常有意義的。因為這種作用力決定兩種分子的相互吸引或者排斥,接近或者離開,化學鍵的形成或者斷裂,生物分子立體構像的維持或者改變等等。在分子間作用力的支配下,還同時支配著生物體內的各種生理現象、生化現象、藥物藥理現象,以及離子通道的開放或關閉,受體與配體的結合或去結合,酶功能的激活或抑制等等。因此,生物分子間作用力的研究,在某種意義上說,就是對生命體功能活動中最根本原理的研究。這也為人們理解生命原理,提供了一個新的研究手段和工具。
將兩種分子分別固定於AFM的基底和探針尖端上。然後使帶有一種分子的探針尖端在垂直方向上不斷地接近和離開基底上的另一種分子。這時,兩種分子間的相互作用力,就是二者間的相對距離的函數。這種力與距離間的函數關係曲線,稱之為力譜曲線。
利用AFM獲得的力譜曲線在生物醫學中的應用:在探測一個細胞之後,根據所遇到的阻力,AFM就會賦予一個表明細胞柔軟度的數值。研究人員發現,儘管正常細胞的硬度各有不同,但癌細胞比正常細胞要柔軟得多,所研究的胰腺、肺部和乳腺細胞均是如此。一些腫瘤的細胞可能比另外一些更為堅硬,那就意味著這些腫瘤惡化轉移的可能性較小,對病人的威脅也較小。利用AFM還可以研究不同藥物對癌細胞的影響。針對細胞用藥后,AFM可以觀察在藥物的作用下細胞的變化情況。這樣可以開發出比當前所用的藥物毒性更小、但同樣能夠阻止正常細胞發生癌變的藥物,以免因癌症擴散而危及生命。
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