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也稱脫氮作用。反硝化細菌在缺氧條件下,還原硝酸鹽,釋放出分子態氮(N2)或一氧化二氮(N2O)的過程。  微生物和植物吸收利用硝酸鹽有兩種完全不同的用途,一是利用其中的氮作為氮源,稱為同化性硝酸還原作用:NO3-→NH4+→有機態氮。許多細菌、放線菌和黴菌能利用硝酸鹽做為氮素營養。另一用途是利用NO2-和NO3-為呼吸作用的最終電子受體,把硝酸還原成氮(N2),稱為反硝化作用或脫氮作用:NO3-→NO2-→N2↑。能進行反硝化作用的只有少數細菌,這個生理群稱為反硝化菌。大部分反硝化細菌是異養菌,例如脫氮小球菌、反硝化假單胞菌等,它們以有機物為氮源和能源,進行無氧呼吸,其生化過程可用下式表示:
C6H12O6+12NO3-→6H2O+6CO2+12NO2-+能量
CH3COOH+8NO3-→6H2O+10CO2+4N2+8OH-+能量
少數反硝化細菌為自養菌,如脫氮硫桿菌,它們氧化硫或硝酸鹽獲得能量,同化二氧化碳,以硝酸鹽為呼吸作用的最終電子受體。可進行以下反應:
5S+6KNO3+2H2O→3N2+K2SO4+4KHSO4
反硝化作用使硝酸鹽還原成氮氣,從而降低了土壤中氮素營養的含量,對農業生產不利。農業上常進行中耕鬆土,以防止反硝化作用。反硝化作用是氮素循環中不可缺少的環節,可使土壤中因淋溶而流入河流、海洋中的NO3-減少,消除因硝酸積累對生物的毒害作用。
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