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可溶性蛋白質

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1解釋

可溶性蛋白指可以以小分子狀態溶於水或其他溶劑的蛋白。通常在植物生理、微生物、食品加工等實驗中作為重要指標。如可溶性蛋白是植物抗寒性的重要指標之一。

2測定

考馬斯亮藍G-250法

考馬斯亮藍G-250

  考馬斯亮藍G-250

【原理】
考馬斯亮藍G-250(GooMAssIe BrIllIAnT Blue G-250)測定蛋白質含量屬於染料結合法的一種。考馬斯亮藍G-250在遊離狀態下呈紅色,在稀酸溶液中,當它與蛋白質的疏水區結合后變為青色,前者最大光吸收在465nM,後者在595nM。在一定蛋白質濃度範圍內(1~100μg),蛋白質與色素結合物在595nM波長下的光吸收與蛋白質含量成正比,故可用於蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2Min左右的時間內達到平衡,完成反應十分迅速,其結合物在室溫下1H內保持穩定。該反應快速靈敏(靈敏度比FolIn-酚法還高4倍)、易於操作、干擾物質少(考馬斯亮藍G-250和蛋白質通過范德華力結合,受蛋白質的特異性影響較小,除組蛋白外,其他不同種類蛋白質染色強度差異不大),可測定微克級蛋白質含量,是一種比較好的蛋白質定量法。但此方法也存在其缺點,考馬斯亮藍在蛋白質含量很高時線性關係偏低,且不同來源蛋白質與色素結合狀況有差異。
【儀器與用具】
721分光光度計;10Ml量筒1個;研缽;燒杯;量瓶;移液管:1Ml 3支,0?1Ml 3支;10Ml具塞刻度試管14支。
【試劑】
標準蛋白質溶液:用牛血清白蛋白配成含蛋白質100μg/Ml的標準蛋白溶液;
90%乙醇;
85%磷酸(W/V);
考馬斯亮藍G-250溶液:稱取100μg考馬斯亮藍G-250,溶於50Ml 90%乙醇中,加入85%的磷酸100Ml,最後用蒸餾水定容到1000Ml,貯放在棕色瓶中,此溶液在常溫下可放置1個月。
【方法】
1?標準曲線(蛋白質含量為0~100μg/Ml)的繪製 取6支具塞試管,按表2-1數據配製含0~100μg/Ml的牛血清蛋白質液各1Ml。
表2-1不同蛋白質含量的牛血清蛋白質液配製表
管號123456蛋白質標準液(ml)00.200.400.600.801.00蒸餾水(ml)1.000.800.600.400.200蛋白質含量(μg)020406080100在每支試管中加入5Ml考馬斯亮藍G-250溶液,蓋塞,反轉混合數次,放置2Min后,用1CM光徑比色杯在595nM下比色。以蛋白質濃度為橫坐標,以吸光值為縱坐標繪製標準曲線。
2.樣品提取液中蛋白質濃度的測定 吸取樣品提取液1.0Ml(樣品提取見LoWry法),放入具塞試管中(每個樣品設置兩個重複),加入5Ml考馬斯亮藍G-250溶液,充分混合,放置2Min后在595nM下比色,記錄吸光值,並通過標準曲線查得蛋白質含量。
3?結果計算
樣品中蛋白質的含量(Mg/g)=C×VTV1×FW×1000(2-2)
式中C:查標準曲線值(μg);VT:提取液總體積(Ml);
FW:樣品鮮重(g); V1:測定時加樣量(Ml)。
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