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單細胞凝膠電泳技術

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單細胞凝膠電泳分析(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)是Ostling等(1984)首創的,以後經Singh等(1988)進一步完善而逐漸發展起來的一種快速檢測單細胞DNA損傷的實驗方法,因其細胞電泳形狀頗似慧星,又稱慧星試驗(cometassay)。

1原理

該技術的原理是基於有核細胞的DNA分子量很大,在DNA超螺旋結構附著在核基質中,用瓊脂糖凝膠將細胞包埋在載玻片上,在細胞裂解液作用下,細胞膜、核膜及其他生物膜破壞,使細胞內的RNA、蛋白質及其他成分進入凝膠,繼而擴散到裂解液中,惟獨核DNA仍保持纏繞的環區附著在剩餘的核骨架上,並留在原位。如果細胞未受損傷,電泳中核DNA因其分子量大而停留在核基質中,經熒光染色后呈現圓形的熒光團,無拖尾現象。若細胞受損,在鹼性電泳液(pH>13)中,先是DNA雙鏈解螺旋且鹼變性為單鏈,單鏈斷裂的碎片分子量小即可進入凝膠中,在電泳時斷鏈或碎片離開DNA向陽極遷移,形成拖尾。細胞核DNA損傷愈重,產生的斷鏈或鹼易變性片段就愈多,其斷鏈或短片也就愈小,在電場作用下遷移的DNA量多,遷移的距離長,表現為尾長增加和尾部熒光強度增強。因此,通過測定DNA遷移部分的光密度或遷移長度就可定量測定單個細胞DNA損傷程度。

2優點

該方法靈敏、簡便、快速、低耗、重複性好,目前已被廣泛應用於體內或者體外各種有核細胞經受試物誘導的DNA損傷和修復的研究。

3實驗舉例

Kizilian(1999)改進了一些試驗條件,能明顯將細胞調亡和細胞壞死的形象與「彗星」區分。MarkS.Rundell等(2003)報道彗星試驗測行的損傷主要是由致突變劑引起的。RichardD.Bowden等(2003)研究出了一種新的分析試驗結果的彗星尾圖譜,可以更加準確的分析彗星的長度及密度。SCGE是評價遺傳毒性損害非常敏感的實驗,可以檢測到每1.657×10-37kg中0.1個DNA的斷裂。與經典的染色體畸變、微核、SCE相比,SCGE可以用於活細胞DNA的檢測,也能用於死亡細胞DNA的分析,使SCGE不僅可以研究低劑量下的生物效應,也可用於研究高劑量下的生物效應;同時SCGE又可提供DNA修復能力的信息,這使得SCGE非常適用於評價受試物的遺傳毒性劑及材料: 
1)PBS
2)0.8%正常熔點凝膠(PBS配製)
3)0.6%低熔點凝膠(PBS配製)
4)毛玻璃片
5)蓋玻片
6)鹼性裂解液(2.5mol/L NaCl;100mmol/L Na2EDTA;10mmol/L Tris;1%肌氨酸鈉),臨用前加10%DNMSO,1%Triton X-100
7)電泳緩衝液(1mmol/L Na2EDTA;300mmol/L NaOH;Tris-HCl,pH7.5)
8)EB(2ug/ml)

4步驟

1.製備第一層膠:100ml 0.8%正常熔點膠,加蓋蓋玻片,4℃固化10min;
2.製備第二層膠:輕輕地去除蓋玻片,在第一層膠上滴加75ul含1×10000個細胞的0.6%低熔點膠(cell與凝膠比例為1:5),加蓋蓋玻片,4℃固化10min;
3.裂解:去掉蓋玻片,將凝膠浸入冰冷的鹼性裂解液內(臨用前加10% DMSO(二甲基亞碸)),1%Triton X-100),4℃裂解1h;
4.取出玻片,用PBS緩衝液漂洗3次後置於水平電泳槽內,加入pH13的電泳緩衝液(沒過玻片2-3min),放置20min(黑閉)。
5.電泳:電壓20V,300mA,30min
6.取出玻片,用PBS或Tris-HCl,pH7.5漂洗3次,每次3min;
7.染色:膠上滴加3ulEB,加蓋蓋玻片,24h檢測。或者4℃,潮濕,閉光的條件下保有膠片,觀察時再染色,鏡檢。
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