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1 回折序列 -回折序列

2 回折序列 -RACEPCR

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RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通過PCR進行cDNA末端快速克隆的技術。
  cDNA完整序列的獲得對基因結構、蛋白質表達、基因功能的研究至關重要。
  完整的cDNA序列可以通過文庫的篩選和末端克隆技術獲得。
  末端克隆技術是20世紀80年代發展起來的。
  RACE的優點
  與篩庫法相比較,有許多方面的優點
  1)此方法是通過PCR技術實現的,無須建立cDNA文庫,可以在很短的時間內獲得有利用價值的信息。
  2)節約了實驗所花費的經費和時間。
  3)只要引物設計正確,在初級產物的基礎上可以獲得大量的感興趣基因的全長。
  實驗室現有的RACE試劑盒的簡介
   RACE是一種從一個相同的cDNA模板進行5『和3『末端快速克隆的方法。此方法會產生較少的錯誤條帶。此過程中使用的酶混合物非常適合長鏈PCR。
   使用此方法的要求是必須知道至少23-28個核苷酸序列信息,以此來設計5』末端和3『末端RACE反應的基因特異性引物(GSPs)。
  RACE引物的設計:
  基因特異性引物(GSPs)應該是:
   23-28nt
   50-70%GC
   Tm值≥65度,Tm值≥70度可以獲得好的結果
  需要實驗者根據已有的基因序列設計5『和3『RACE反應的基因特異性引物(GSP1和GSP2).由於兩個引物的存在,PCR的產物是特異性的。
  反應中涉及到的一些事項
   cDNA的合成起始於polyA+RNA。如果使用其它的基因組DNA或總RNA,背景會很高。
   RACEPCR的效率還取決於總的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸溫度。
   在進行5『和3』RACEPCR的時候應該使用熱啟動。
   表4中給出了所有引物的相互關係。重疊引物的設計會對全長的產生有幫助。另外,重疊的引物可以為PCR反應提供一個對照。並不是絕對的要利用設計的引物產生重疊片段。
   引物GSP中的GC含量要在50-70%之間。這樣可以使用降落PCR。避免使用自身互補性的引物序列,否則會產生回折和形成分子內氫鍵。另外,避免使用與AP1互補的引物,尤其是在3『末端。
  如果要用重疊片段來檢測設計的引物,GSp1和GSp2之間至少是100-200鹼基。只有這樣才可以用擴增的產物來鑒定設計的引物是否正確。
   降落PCR可以明顯的增加RACEPCR產物的特異性。在最開始的循環中,退火溫度高於AP1引物的Tm值,可以增加對特異性條帶的擴增。隨後的退火和延伸的溫度降回到AP1的溫度,可以進行隨後的PCR循環。
   驗證基因特異性引物的對照:
   單個引物的陰性對照:只用一個引物GSP來進行陰性對照。這樣不應該產生任何的條帶。如果可以看到明顯的產物,應該改變循環的參數,或重新設計原始引物。
   利用兩個GSPS進行陽性對照:(只有兩個GSP可以產生重疊的時候才可以採用此步。)為了確定RNA樣品中目的基因確實表達,利用兩個GSP和接頭連接的cDNA來產生陽性對照。可以產生兩個引物之間的重疊大小的片段。如果沒有這個片段,應該重複cDNA的合成,或者從一個不同的組織或細胞來源進行cDNA的合成。
   製備和抽提polyA+RNA
  不要使用DEPC處理過的水。
  純化完mRNA之後,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA的質量。哺乳動物的mRNA樣品是0.5-12kb的拖帶,在其中有4.5和1.9kb的rRNA的條帶。非哺乳動物的mRNA應略小
  具體的實驗步驟
  cDNA第一條鏈的合成:
   我們建議進行cDNA合成的對照反應,這樣可以對樣品的cDNA的合成進行鑒定。加入各種試劑之後,在氣浴中42度保溫一個小時。
  注意:在水浴或酒精浴中保溫回減少反應體積,從而降低第一鏈的合成效率。
  將管放於冰上,以終止第一鏈的合成反應。
  直接進行第二鏈的合成。
   cDNA第二鏈的合成:
  第二鏈合成的酶混合物中,含有聚合酶、RNaseH和連接酶。T4DNA聚合酶的功能是補平dscDNA的末端。我們建議做陽性對照,試劑盒中提供人類骨骼肌的mRNA。
   建議進行陽性對照,cDNA的質量取決於製備的polyA+RNA的質量。非哺乳動物樣品的mRNA大約在0.5-3kb之間。
   通過電泳檢測cDNA的產量,與對照進行對比,這樣可以有利於在以後的步驟中對cDNA進行稀釋。
  接頭的連接及連接產物的稀釋
   按照程序進行連接反應。
   如果沒有對比樣品和對照的產量,利用Tricine-EDTAbuffer製備接頭連接的dscDNA的1/50和1/250的稀釋物,用兩種稀釋物進行以下的RACEPCR反應,直到鑒定出哪一種稀釋可以得到好的效果。
  RACERACE--PCRPCR擴增擴增
  •進行5』和3』的RACE-PCR擴增。
  •利用以下的程序進行降落PCR反應:
  94度30秒
  5個循環:94度5秒
  72度4分
  5個循環:94度5秒
  70度4分鐘
  20-25個循環:94度5秒
  68度4分鐘
  注意:我們建議使用降落PCR反應,這就要求GSP的Tm值≥70度。
  當循環結束時,利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析每一個管中的產物5μl,使用適當的分子量marker。
  •可以根據你的基因的特異性來設計最理想的循環參數。如果看不到帶或者只有微弱的帶,在68度多加5個循環。最佳的延伸時間取決於擴增條帶的長度。如果片斷的長度在2-5kb的時候,經常使用4min,0.2-2kb的時候將延伸時間減到2-3min,對於5-10kb的條帶,延伸時間增加到10min。
  RACE產物的驗證:
   應該對RACE的片段進行驗證,以此來確定是否已經擴增了理想的產物。如果得到的是多條帶或者研究的是多基因家族的成員,驗證是非常有用的。
   有3種驗證RACE產物的方法:
  (1)比較由GSP和NGSP獲得RACE產物。
  (2)Southernblot
  (3)克隆並測序

   我們建議最好測得RACE產物的部分序列。有的時候需要嵌套引物的存在。
  比較由GSP和NGSP獲得RACE產物。
   對於5『末端的RACE產物,比較由AP1和GSP1擴增出來的產物和由AP1和NGSP1擴增出來的產物。
   對於3『末端的RACE產物,比較由AP1和GSP2擴增出來的產物和由AP1和NGSP2擴增出來的產物。這對於鑒定多條帶是否是上一個PCR的特異性產物是非常有用的。
   如果條帶是正確的,在嵌套PCR反應中的條帶應該是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR產物的遷移率的不同取決於cDNA結構中GSP1和嵌套引物的位置。
  RACE產物的克隆和測序:
   可以利用膠回收試劑盒來回收RACE產物,此試劑盒適合回收2.5kb以下的RACE產物;對於長的片段,可以通過電洗脫獲得好的結果。如果你選擇使用其他的純化方法,最後用Tricine-EDTAbuffer30μl重新懸浮DNA樣品。
   電泳5μl回收的樣品來鑒定回收的質量。
   將回收的PCR產物直接克隆到/A型的PCR克隆載體中。另外還可以利用接頭和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、Ecor1等酶切位點,將產物克隆到常規載體中
  對於5『端的RACE產物,我們建議挑取至少8-10個不同的克隆以獲得5『端的最大可能性的序列。(反轉錄並不總是進行到mRNA模板的5』末端,尤其是長模板。另外,T4DNA聚合酶會移走5『末端的0-20個鹼基。)
   一旦鑒定了含有插入片斷的克隆,應該獲得多的序列信息。理想的是,可以對整個開放讀碼框進行測序。包括5『和3『的非翻譯區。
  全長cDNA的獲得
   通過部分或全部測序鑒定了RACE產物后,可以通過兩種選擇獲得全長的cDNA。
  通過PCR的方法。
  通過克隆的方法。
  通過PCR的方法獲得全長cDNA:
   擴增長的cDNA需要較長的延伸時間,但是如果延伸的時間過長,可以產生拖帶,所以要慎重的設計引物。
   根據從5『和3『RACE產物獲得序列信息設計5』和3『GSP引物。這些引物應該來自cDNA的3』或者5『的末端,應該是23-28nt長。不應該在引物的末端加上限制性位點,這樣會導致高背景。在某些時候可以設計3』和5『的嵌套引物。但是還是應該先利用一對引物進行PCR反應。
  通過PCR的方法獲得全長cDNA:
   進行如下的熱循環:
  94度30秒
  25個循環94度5秒
  72度2-15分鐘
   延伸的時間應該等於預期的cDNA長度加上2分鐘。例如:預期得到6kb的條帶,用6+2=8分鐘的延伸時間。
   注意:如果沒有條帶或者條帶弱,增加5個循環;或者優化PCR的條件。
  通過PCR的方法獲得全長cDNA:
   在1.2%的瓊脂糖凝膠上分析5μl的樣品。通常情況下,可以見到一條單一帶,如果這樣,利用膠來純化全長的cDNA。
   製備1.2%的TAEbuffer製備瓊脂糖凝膠。不使用TBEbuffer,TBE的膠很難製備全長的cDNA。
   將剩下的45μl反應物點樣,選用適當的marker。
   利用長波紫外觀察cDNA(≧300nm)切下全長的cDNA。注意:應該盡量減少紫外對cDNA的照射。
  通過PCR的方法獲得全長cDNA:
   利用膠回收試劑盒回收cDNA。此試劑盒適合回收2.5kb以下的RACE產物;對於長的片段,可以通過電洗脫獲得好的結果。如果你選擇使用其他的純化方法,最後用Tricine-EDTAbuffer30μl重新懸浮DNA樣品。
   將全長的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆載體中。
  通過克隆產生全長的cDNA:
   如果你已經獲得了含有重疊部分的5『和3』RACE產物,同時在cDNA的重疊部分含有一個酶切位點的話,通過克隆技術可以獲得全長的cDNA。
   利用酶切獲得的3『和5』擴增產物,並且利用T4DNA連接酶將它們連接起來。利用接頭和cDNA合成引物中的內切酶將最終的全長cDNA克隆到載體中。
   在哺乳動物基因組中,NOT1和Srf1酶切非常稀少,大約106bp才出現一次,因此在絕大多數的cDNA中是不出現的。
  Appendix:cDNA接頭和引物 接頭在設計的時候可以使cDNA的擴增成功進行: 接頭的5『端在第一個循環中沒有AP1引物的結合位點。AP1的結合位點只有通過GSP的擴增之後才能夠產生。 這些特點中的每一個都可幫助減少cDNA片段擴增過程中出現的非特異性擴增。另外,它們允許從一個複雜的DNA片段的混合物中擴增出靶樣品――所有的產物都有相同的末端結構,因為使用了單一的一套GSPs。

4 回折序列 -參考資料

http://baike.baidu.com/view/1579416.htm

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