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基因擴增技術

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基因擴增技術(PCR)聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction簡稱PCR)又稱無細胞分子克隆系統或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增法,是基因擴增技術的一次重大革新。可將極微量的靶DNA特異地擴增上百萬倍,從而大大提高對DNA分子的分析和檢測能力,能檢測單分子DNA或對每10萬個細胞中僅含1個靶DNA分子的樣品,因而此方法立即在分子生物學、微生物學、醫學及遺傳學等多領域廣泛應用和迅速發展。由於PCR具有敏感性高、特異性強、快速、簡便等優點,已在病原微生物學領域中顯示出巨大的應用價值和廣闊的發展前景。

1簡介

PCR技術是由Cetus公司和加利福尼亞大學1985年聯合創造的,主要貢獻者為Kary B mulis和HeneryA、Erlich。該方法首先被應用於人β-珠蛋白DNA的擴增及鐮刀狀紅細胞貧血病的產前診斷。自85年首次報道PCR方法以來,PCR被廣泛應用於分子克隆、序列分析、基因突變、遺傳病、傳染病、性傳播性疾病及法醫判定和考古研究等多領域、併發揮了越來越大的作用。因而發明人Kary B、mulis獲1993年諾貝爾化學獎。

2基本原理和程序

PCR擴增DNA的原理是:先將含有所需擴增分析序列的靶DNA雙鏈經熱變性處理解開為兩個寡聚核苷酸單鏈,然後加入一對根據已知DNA序列由人工合成的與所擴增的DNA兩端鄰近序列互補的寡聚核苷酸片段作為引物,即左右引物。此引物範圍就在包括所欲擴增的DNA片段,一般需20-30個鹼基對,過少則難保持與DNA單鏈的結合。引物與互補DNA結合后,以靶DNA單鏈為模板,經反鏈雜交復性(退火),在Taq DNA聚合酶的作用下以4種三磷酸脫氧核苷(dNTP)為原料按5'到3'方向將引物延伸、自動合成新的DNA鏈、使DNA重新複製成雙鏈。然後又開始第二次循環擴增。
引物在反應中不僅起引導作用,而且起著特異性的限制擴增DNA片段範圍大小的作用。新合成的DNA鏈含有引物的互補序列,並又可作為下一輪聚合反應的模板。如此重複上述DNA模板加熱變性雙鏈解開—引物退火復性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循環過程,使每次循環延伸的模板又增加1倍,亦即擴增DNA產物增加1倍,經反覆循環,使靶DNA片段指數性擴增。
PCR的擴增倍數Y=(1+E)n,這裡Y是擴增量,n為PCR的循環次數。E為PCR循環擴增效率。設PCR擴增效率E為100%、循環次數n=25次,靶DNA將擴增到33554432個拷貝,即擴增3355萬倍:若E為80%、n=20、則擴增數量將下降到1408865拷貝,即擴增產物約丟失93%,若E=100%,n=20,則擴增數量減少1048576個拷貝,擴增產物約減少97%。可見PCR循環擴增效率及循環次數都對擴增數量有很大影響。
PCR擴增屬於酶促反應,所以,DNA擴增過程遵循酶促動力學原理。靶DNA片段的擴增最初表現為直線上升,隨著靶DNA片段的逐漸積累,當引物—模板/DNA/聚合酶達到一定比值時,酶的促化反應趨於飽和,此時靶DNA產物的濃度不再增加,即出現所謂平台效應。PCR反應達到平台期的時間主要取決於反應開始時樣品中的靶DNA的含量和擴增效率,起始模板量越多到達平台期的時間就越短、擴增效率越高到達平台期的時間也越短。另外酶的含量,dNTp 濃度,非特異性產物的擴增都對到達平台期時間有影響。

3PCR的特點

高度敏感
理論上PCR可以按2n倍數擴增DNA十億倍以上,實際應用已證實可以將極微量的靶DNA成百萬倍以上地擴增到足夠檢測分析量的DNA。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞,或對諸如病人口液等只含一個感染細胞的標本或僅含0.01pg的感染細胞的特異性片段樣品中均可檢測。
簡便
擴增產物可直接供作序列分析和分子克隆,擺脫繁瑣的基因方法,可直接從RNA或染色體DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因,省去常規方法中須先進行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的組織或切片亦可檢測。如在PCR引物端事先構建一個內切酶位點,擴增的靶DNA可直接克隆到M13,PUC19等相應酶切位點的載體中。
(一)試劑
(1)引物:決定擴增的特異性。根據檢測的DNA不同,選用不同引物,每種病原微生
物都有自己特異的引物。
(2)耐熱的DNA聚合酶:此酶是從耐熱細菌中分離出來的,能耐受高溫90℃-100℃。
(3)10×PCR緩衝液:500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。10×PCR緩衝液隨酶一起購買。
(4)5mmol/L dNTP貯備液:將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合併,加入滅菌去離子水溶解,用NaOH調pH至中性,分裝每份300μl,-20℃保存。dNTP濃度最好用UV吸收法精確測定。現用dNTP溶液均有商品化產品。
(5)DNA模板:用處理液將待測標本處理,不同處理方法、操作各異,但目的是暴露標本中被檢測的DNA。
模板核酸
PCR可以以DNA或RNA為模板進行核酸的體外擴增。不過RNA的擴增首先逆轉錄成cDNA后才能進行PCR循環。不同來源的核酸標本必須經處理后才能用於PCR的擴增,處理不當或處理過程中DNA掉失都會導致PCR擴增失敗。採集標本方法不當,未能獲得所要檢測的靶DNA都會導致出現假陰性。但是如果待擴增標本中模板DNA濃度太高也會導致擴增失敗。
緩衝液
PCR反應的緩衝液的目的是給Taq DNA聚合酶提供一個最適酶催反應條件。目前最為常用的緩衝體系為10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8,20℃) Tris是一種雙極性離子緩衝液,20℃時其pKa值為8.3,△pKa值為-0.021/℃。因此,20mmol/l Tris-HCl(pH8.3,20℃)在實際PCR中,pH變化於6.8-7.8之間。改變反應液的緩衝能力,如將Tris濃度加大到50mmol/L,pH8.9,有時會增加產量。
反應混合液中50mmol/L以內的KCl,pH8.9有利於引物的退火,50mmol/l NaCl或50 mmol/L以上的KCl則抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反應液中以NH+4代K+,其濃度為16.6mmol/L。反應中加入小牛血清白蛋白(100μg/ml)或明膠(0.01%)或Tween 20(0.05% ~0.1%)有助於酶的穩定,反應中加入5mmol/l 的二硫蘇糖醇(DTT)也有類似作用,尤其在擴增長片段(此時延伸時間長)時,加入這些酶保護劑對PCR反應是有利的。
三磷酸脫氧核苷酸
四種脫氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)是DNA合成的基本原料,PCR反應中dNTP含量太低,PCR擴增產量太少、易出現假陰性。過高的dNTP濃度會導致聚合將其錯誤摻入(即所謂的「熱力背信」),因此應當避免。一般認為最適的dNTP濃度為50~200μmol/L。dNTP的質量也直接影響PCR反應的成敗。
溫度循環參數
1.變性溫度與時間
PCR反應中模板DNA的變性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR產物雙鏈完全解開,才能有效的和引物結合。這種結合是PCR擴增的基礎。變性溫度越高,時間越長變性就越充分。但溫度過高、時間過長又會影響Taq DNA聚合酶的活性,所以通常選用變性溫度為95℃30s為宜。在PCR反應中第一個循環變性最重要,需時間較長,因模板DNA的鏈比較長。
2.復性溫度與時間
變性溫度是PCR反應成敗的關鍵,復性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復性越好,但是容易出現引物與靶DNA的錯配,增加非特異性結合,溫度太高不利於復性,大多數PCR反應的復性溫度在55℃左右。確定了復性溫度后,復性時間並不是關鍵因素。但復性時間太長會增加非特異的復性。
3.延伸溫度與時間
引物延伸溫度一般為72℃。這個溫度即考慮了Taq DNA聚合酶的活性,又考慮到引物和靶基因的結合。不合適的延伸溫度不僅會影響擴增產物的特異性,也會影響其產量,72℃時,核苷酸的合成速度為35-100個核苷酸/S,這取決於緩衝體系、pH、鹽濃度和DNA模板的性質。72℃延伸1min對於長達2kb的擴增片段是足夠的。然而,延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對很低濃度底物的擴增,延伸時間要長些。
4.循環數:
循環數決定著擴增的產量。在其它參數都已優化條件下,最適循環數取決於靶序列初始濃度。靶序列的初始濃度較低時、要增加循環次數。另外,酶活性不好,或量不足時也要增加循環次數、以便達到有效的擴增量。

4PCR標本的製備

在將Taq DNA聚合酶引入PCR反應,並使之達到自動化之後,PCR反應已變得十分的簡單了。但是PCR樣品的採集及製備卻並非同樣簡單,而且,許多PCR的失敗都歸因於標本的製備不當。用於PCR的標本必須經適當處理后才能使用,因為標本中的許多雜質能抑制Taq DNA聚合酶的活性。另外,處理標本可使待擴增DNA暴露,能與引物復性。關於PCR標本製備各種專業書中介紹了許多,我們實驗發現操作複雜、不慎便容易造成污染,且不實用。現介紹一種簡單快速的處理方法即3%異硫氰酸胍和待檢標本混合100℃,10min,離心取上清作為PCR模板即可。

5實驗中常見問題對策

所有實驗結果都有成功或失敗,實驗的失敗可能是應該出結果而沒有出,我們把它稱作假陰性,不該出結果而出了結果我們把它稱為假陽性。PCR實驗中最常見的問題就是假陰性和假陽性問題。
(二)假陽性
PCR結果的假陽性是對被檢測標本而言,而反應系統中所擴增的產物是真實的。因為PCR技術高度靈敏,極其微量的靶基因污染都會造成大量擴增,而造成結果判斷上的失誤,所以污染是PCR假陽性的主要根源。PCR的污染主要是標本間的交叉污染和擴增子的污染。出現假陽性結果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列。為了避免因污染而造成的假陽性,PCR操作時要隔離不同操作區、分裝試劑、簡化操作程序,使用一次性吸頭。

6PCR擴增產物的分析法

PCR擴增DNA片段只是一個重要手段。擴增片段的檢測和分析才是目的,根據研究對象和目的的不同而採用不同的分析法。瓊脂糖凝膠電泳可幫助判斷擴增產物的大小,有助於擴增產物的鑒定,點雜交除可鑒定擴增產物外,還有助於產物的分型;Southern雜交分析可從非特異擴增產物中鑒定出特異產物的大小,增加檢測的特異性與敏感性,最近發展的一系列產物分析法(PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等)均有助於產物的精確分析。
點雜交
當擴增產物是多條帶時,用點雜交更合適。這種方法的基本過程是,首先將擴增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上,再用放射性或非放射性標記物標記的探針雜交。點雜交還有助於檢測突變DNA的突變類型,用於人類遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同位素32P標記的寡核苷酸探針檢測的敏感性、特異性和方法的可靠性均不容懷疑,對人們認識某些疾病與基因變異的關係起了很大的作用。但是,由於同位素不穩定和放射性危害,不能常規用於臨床或法醫檢驗,用非放射性物質(生物素、熒光素和地高辛等)標記的寡核苷酸探針分析PCR產物以確定核酸序列變異則是一種簡便而安全的方法。非放射性標記物質穩定性高,使用方便、安全、檢測速度快。
PCR-ELISA法
本法避免了電泳和雜交的步驟,適於常規ELISA記數儀檢測。因為5'端修飾后仍可進行常規PCR擴增特異靶序列。因此,可以通過修飾一個引物的5′端使其攜帶便於PCR產物固定的功能基因,而通過另一引物5′-端的修飾使產物便於檢測。
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