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多肽主要是有碳、氫、氧、氮4種元素組成,氨基酸是組成多肽的基本單位。2個或2個以上氨基酸以肽鍵相連的化合物就是多肽。由幾個氨基酸以肽鍵相連的化合物就是幾肽。多 肽能全面調節人體的各種各樣的生理功能,具有分子小,活性高,穿透力強,專一性等特點。多肽和蛋白質是兩種不同的物質,儘管多肽屬於蛋白質範疇,但不是人們想象的蛋白質,而是一種功能性蛋白質,或稱為前體蛋白質。

1 多肽 -基本概述

多肽結構多肽結構

氨基酸之間可以通過肽鍵相連,兩個氨基酸相連為二肽,依此類推還有三肽、四肽……如果相連的氨基酸少於十個則被稱為寡肽(小分子肽),超過十個就是多肽了,而超過五十個就被稱為蛋白質了。

氨基酸通過肽鍵(-CO-NH-)相連而形成的化合物稱為肽(peptide)。由兩個氨基酸縮合成的肽稱為二肽,三個氨基酸縮合成三肽,以此類推。一般由十個以下的氨基酸縮合成的肽統稱為寡肽,由十個以上氨基酸形成的肽被稱為多肽(polypeptide)或多肽鏈。

氨基酸在形成肽鏈后,氨基酸的部分基團已參加肽鍵的形成,已經不是完整的氨基酸,稱為氨基酸殘基。肽鍵連接各氨基酸殘基形成肽鏈的長鏈骨架,即…Cα-CO-NH-Cα…結構稱為多肽主鏈。各氨基酸側鏈基團稱為多肽側鏈。每個肽分子都有一個遊離的α-NH2末端(稱氨基末端或N端)和一個遊離α-COOH末端(稱羧基末端或C端)。每條多肽鏈中氨基酸順序編號從N端開始。書寫某多肽的簡式時,—般將N端書寫在左側端。

多肽是人體自身存在而且必需的活性物質,是人體的重要組成物質、營養物質,它廣泛分佈於人體各處,特別是大腦里,對幾乎所有的細胞都有調節作用。人體缺失了多肽,免疫系統、各功能系統就會發生紊亂,就會出現各種慢性病。

多肽與氨基酸的區別與聯繫:

從結構上講,氨基酸是組成多肽的基本單位,多肽的分子一般比氨基酸分子大。
從吸收上講,人體吸收蛋白質主要是以多肽的形式吸收,而不是以氨基酸的形式吸收,且多肽吸收時有十大特點。
從合成蛋白質上講,多肽在人體內合成蛋白質比氨基酸高。
從數量上講,人體內氨基酸只有20種,而肽不知有多少種。
從功能上講,氨基酸的功能屈指可數,而多肽的功能成千上萬。

多肽與蛋白質的區別與聯繫:

從結構上講,多肽的分子量小、肽鍵的數目少、肽鏈短;蛋白質的分子量大、肽鍵的數目多、肽鏈長、有立體結構。
從功能上講,蛋白質的生理功能主要由肽來完成,即「肽是生命的統帥,生命是肽的反應體系」。
從營養上講,多肽的營養優於蛋白質,蛋白質主要分解成肽才能吸收。多肽是一種功能性蛋白質,食用后不但不會引起營養過剩,而且還可以調節人體的營養平衡。

2 多肽 -溶解性

大多數肽的首選溶劑是超純抽氣水。稀乙酸或氨水分別對於鹼性或酸性多肽的溶解很重要。這些方法不溶的多肽, 需要DMF、脲、guanidiniam chloride或acetonitrnle來溶解,這些溶劑可能某些實驗有副作用。所以我們建議設計多肽時要加註意。   

殘基Ala, Cys , Ile, Leu, Met, Phe和Val將全增加多肽的溶解難度。

3 多肽 -保存方法

多肽多肽——分子結構

多肽在-20℃很穩定,特別是冷凍乾燥並保存在乾燥器中,在將它們暴露於空氣之前, 冷凍乾燥多肽可以放於室溫。這將是濕度影響減少,當無法冷凍乾燥時,最好的方法是以小的工作樣量存放。

對於含Cys, Met orTrP的多肽,脫氧緩衝劑對其溶解必不可少,因為這種多肽可易空氣氧化, 在封瓶前,慢慢流過多肽的氮氣或氬氣也會降低氧化作用。含Gln或Asn的多肽也容易降解,所有這些肽與不含這些有問題解苷的那些肽相比,生命期有限。

多肽具廣泛的溶解性。多肽不溶的主要問題是形成二級結構。除了最太肽外,這點都會發生, 在有多重疏水殘基的肽中更顯著。鹽會促進二級結構形成。我們建議先在無菌蒸餾水或去離子中溶解多肽。如需要增加溶解率, 可用聲處理。溶解仍有問題, 加少量稀乙酸(10%)或氨水,會便於溶解。

要長期保存多肽, 最好冷凍乾燥,冷乾粉可在-20℃或更低存放幾年而很少或無降解。溶液中的多肽遠不穩定。 多肽易受細菌降解,應用無菌純化水溶解。

含有Met, Cgs或Try殘基的多肽溶液由於氧化,壽命有限。應溶於無氧溶劑, 為防止重複凍融的破壞, 建議溶解過量的肽的便實驗,其餘多肽以固體形成保存。

4 多肽 -對人體的影響

主要控制人體的生長、發育、免疫調節和新陳代謝,它在人體處於一種平衡狀態,若活性肽減少后,人體的機能發生重要變化,對於兒童來說,他的生長、發育變得緩慢,甚至停止,長久下去就形成了侏儒,對成年人或老年人,缺少活性肽后,自身的免疫力就會下降,新陳代謝紊亂,內分泌失調,引起各種疾病的產生,如失眠、身體消瘦或浮腫。由於活性肽還作用於神經系統,因此人體就會變得動作遲緩,頭腦不再聰慧,更主要的是活性肽減少,直接引起人身體各部位逐漸出現全面衰老,引發各種疾病.

5 多肽 -合成介紹

多肽多肽——營養藥物

多肽合成是一個重複添加氨基酸的過程,合成一般從C端(羧基端)向 N端(氨基端)合成。過去的多肽合成是在溶液中進行的。現在多採用固相 合成法從而大大的減輕了每步產品提純的難度。為了防止副反應的發生,合 成柱和添加的氨基酸的側鏈都是被保護的。羧基端是遊離的,並且在反應之 前必須活化。化學合成方法有兩種,即Fmoc和tBoc。由於Fmoc比tBoc存在很 多優勢,現在大多採用Fmoc法合成。

具體合成由下列幾個循環組成:
一、去保護:Fmoc保護的柱子和單體必須用一種鹼性溶劑(piperidine)去 除氨基的保護基團。

二、激活和交聯:下一個氨基酸的羧基被一種激活劑所激活。激活的單體 與遊離的氨基反應交聯,形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅使反 應完成。循環:這兩步反應反覆循環直到合成完成。 洗脫和脫保護:多肽從柱上洗脫下來,其保護基團被一種脫保護劑(TFAl) 洗脫和脫保護。

6 多肽 -生產方法

固相合成法、液相合成法生產
多肽固相合成法多肽固相合成法
    用這種方法生產肽的企業在美國矽谷就有一家。他們主要是購買世界上一些精細化工廠生產的氨基酸為原料定向合成某種單肽,屬醫藥原料中間體,主要用於西藥配方,以增強藥效、增強人體對葯的吸收速度和吸收率。
    固相多肽合成已經有40年的歷史了,然而到現在,人們還只能合成一些較短的肽鏈,更談不上隨心所欲地合成蛋白質了,同時合成中的試劑毒性,昂貴費用,副產物等一直都是令人頭痛的問題,而在生物體內,核糖體上合成肽鏈的速度和產率都是驚人的,那麼,是否能從生物體合成蛋白質的原理上得到一些啟發,應用在固相多肽合成(樹脂)上,這是一個令人感興趣的問題,也許是今後多肽合成的發展。
 酸解法或鹼解法生產   這種肽主要出現在日本。用酸解法生產的「大豆多肽」,屬「食品添加劑」,主要用於老人和兒童食品,其目的是增強這兩種人群對食品營養的吸收。現在,世界上擁有「大豆多肽」的國家只有日本和中國。但其所用的原料、水解法和產品性質大有不同。日本所用原料是豆粕,水解方法是酸法,生產的肽酸性化學物質難以除盡,而且有苦味,需用活性炭吸附、脫苦,而活性炭免不了會侵入肽體。 酶法生產

  酶法生產的生物活性肽。這種肽主要產在中國,代表著當今世界肽研究、開發、生產、創新的水平和潮流。酶法生產的生物活性肽是用人體所需要的食品級植物蛋白酶,將人體平常所食的食物蛋白質酶解成小分子活性多肽。它具有極強的生物活性和多樣性,已在世界範圍內引起關注,成為當今世界追崇的熱點。如武漢九生堂生產的「大豆多肽」,所用原料是含量在90%以上的大豆分離蛋白,水解方法是酶法,所用的酶屬食品級植物蛋白酶。生產的「大豆多肽」無苦味,且風味芳香宜人,對人體無任何毒副作用。產品屬終端產品,被中國創新基金列為無償資助項目,現在已實現工業化生產,其終端產品「大豆多肽」口服液是世界上第一個用酶法生產的大豆多肽終端產品,在第89屆廣交會上受到世界客商的青睞。

7 多肽 -多肽藥物的研究開發

·多肽疫苗

多肽多肽——結構式
多肽疫苗與核酸疫苗一樣是目前疫苗研究領域內較受重視的研究方面之一。尤其是對病毒多肽疫苗進行了大量研究。

目前對人類危害極大的兩種病毒性疾病艾滋病和丙型肝炎均無理想的疫苗,核酸疫苗和多肽疫苗的研究結果令人鼓舞。1999年美國NIH公布了兩種HIV-I病毒多肽疫苗,對人體進行的Ⅰ期臨床試驗結果,證實兩種多肽能刺激機體產生特異性抗體和特異性細胞免疫,並有較好的安全性。中國清華大學也證實HIV-I膜蛋白內一段多肽有很強的免疫原性。丙肝病毒多肽疫苗也顯示有良好的發展前景,國外學者從丙肝病毒(HCV)外膜蛋白E2內篩選出一般多肽,它可刺激機體產生保護性抗體。其它病毒(如甲肝、麻疹、辛德畢斯病毒等)的多肽疫苗及抗腫瘤,避孕等多肽疫苗的研究也取得了較大進展。例如,美國學者NaZ等從噬菌體肽庫內篩選出一個12氨基酸小肽,它能特異性地與人卵子結合,阻止精子與卵子的結合,可用於避孕疫苗。

·抗腫瘤多肽

腫瘤的發生是多種原因作用的結果,但最終都要涉及及癌基因的表達調控。不同的腫瘤產生時所需要的酶等調控因子不同,選擇特異性小肽作小於腫瘤發生時所需的調控因子等,封閉其活性位點,可防止腫瘤發生。現在已發現很多腫瘤相關基因及腫瘤產生調控因子,篩選與這些靶點特異結合的多肽,已成為尋找抗癌藥物的新熱點。美國學者發現了一個小肽(6個氨基酸),它在體內能顯著抑制腺癌的生長,包括肺、胃及在大腸腺癌為治療這一死亡率很高的惡性腫瘤開闢了一條新路。瑞士科學家發現另外一個小肽(8個氨基酸),它能進入腫瘤細胞,激活抗癌基因P53,誘導腫瘤細胞的凋亡。

·抗病毒多肽

病毒感染后一般要經歷吸附(宿主細胞)、穿入、脫殼、核酸複製,轉錄翻譯,包裝等多個階段。阻止任一過程均可防止病毒複製。最有效的抗病毒藥物應該是作用在病毒吸附及核酸複製兩個階段,因此篩選抗病毒藥物主要集中在病毒複製的這兩個階段。病毒通過與宿主細胞上的特異受體結合吸附細胞,依賴其自身的特異蛋白酶進行蛋白加工及核酸複製。因此可從肽庫內篩選與宿主細胞受體結合的多肽或能與病毒蛋白酶等活性位點結合的多肽,用於抗病毒的治療。

HCV非結構蛋白3區(NS3)是一個與病毒複製密切相關的蛋白酶,其活性位點已被確定,並且加拿大、義大利等國家均從肽庫內篩選到一個6肽(DDIVPC)能顯著抑制該酶活性。同樣已從肽庫內篩選到能與HIV複製必需的逆轉錄酶結合的小肽,及能與HIV外膜蛋白結合防止病毒進入細胞的小肽。這些部分小肽已進入臨床試驗。

·多肽導向藥物

已知很多毒素(如綠膿桿菌外毒素),細胞因子(如白細胞介素系列)等有較強的腫瘤細胞毒性,但在人類長期或大量使用量時也可損傷正常細胞。將能和腫瘤細胞特異結合的多肽與這些活性因子進行融合,則可將這些活性因子特異性地集中在腫瘤部位,可大大降低毒素、細胞因子的使用濃度,降低其副作用。比如,在很多腫瘤細胞表面存在表皮生長因子的受體,其數量較正常細胞上的數目高几十倍,甚至上百倍,將毒素或抗腫瘤細胞因子與表皮生長因子融合,可將這些活性因子特異地聚集到腫瘤細胞,國內外已有幾家將表皮生長因子與綠膿桿菌外毒素融合表達成功。同從肽庫內篩選出能與腫瘤抗原特異結合的小肽,也可用於導向藥物,因其分子量小,比鼠源性的單克隆抗體更適合用於導向藥物。

·細胞因子模擬肽

利用已知細胞因子的受體從肽庫內篩選細胞因子模擬肽,近年成為國內外研究的熱點。國外已篩選到了人促紅細胞生成素,人促血小板生成素,人生長激素、人神經生長因子及白細胞介素1等多種生長因子的模擬肽,這些模擬肽的氨基酸序列與其相應的細胞因子的氨基酸序列不同,但具有細胞因子的活性,並且具有分子量小的優點。這些細胞因子模擬肽正處於臨床前或臨床研究階段。

·抗菌性活性肽

當昆蟲受到外界環境刺激時產生大量的具有抗菌活性的陽離子多肽,已篩選出百餘種抗菌肽,體內外實驗證實,多個抗菌肽不僅有很強的殺菌能力還能殺死腫瘤細胞。例如,從蠶體內篩選的抗菌肽D表現了很好的應用前景,並能利用基因工程技術生產。蛇毒內也存在多種活性多肽,從蛇毒內分離出一個13個氨基酸(INKAIAALAKKLL)小肽,其對G+及G-菌均有極強的殺菌能力。

·用於心血管疾病的多肽

很多植物中藥有降血壓、降血脂、溶血栓等作用,不僅可用作藥物,亦可用作保健食品。但由於其作用成份不能確定。其應用受到很大限制。現已發現很多有效成分是小分子多肽,比如中國科學家從大豆內加工分離出的活性多肽,可通過小腸直接吸收,能防治血栓,高血壓和高血脂,還能延緩變老,提高肌體腫瘤力。從人蔘、茶葉、銀杏葉等植物內也分離出很多用於心血管疾病的小肽。

·其它藥用小肽

小肽藥物除在上述幾大方面已取得較大進展外,在其它很多領域也取得一些進展。比如stiernberg等發現一個合成肽(TP508)肽能促進傷口血管的再生,加速皮膚深度傷口的癒合。Pfister等發現一個小肽(RTR)4能防止鹼損傷角膜內炎症細胞的侵潤,抑制炎症反應。Carron等證實其篩選的2個合成肽能抑制破骨細胞對骨質的重吸收。

·診斷用多肽

多肽在診斷試劑中最主要的用途是用作抗原檢測病毒、細胞、支原體、螺旋體等微生物和囊蟲、錐蟲等寄生蟲的抗體,多肽抗原比天然微生物或寄生蟲蛋白抗原的特異性強,且易於製備,因此裝配的檢測試劑,其檢測抗體的假陰性率和本底反應都很低,易於臨床應用。現在用多肽抗原裝配的抗體檢測試劑包括:甲、乙、丙、庚或肝病毒、艾滋病病毒、人巨細胞病毒、單純皰疹病毒、風疹病毒、梅毒螺旋體、囊蟲、錐蟲、萊姆病及類風濕等。使用的多肽抗原大部分是從相應致病體的天然蛋白內分析篩選獲得,有些是從肽庫內篩選的全新小肽。

8 多肽 -其它方面

·重建和操作

多肽多肽——螺旋結構
多數肽溶於無菌蒸溜水。初次溶解時,要注意使初始濃度比要求濃度大,如果多肽僅有限溶解性,這便允許加入其它溶解劑或緩衝鹽。

如果多肽在水中的溶解性有限,有幾種選擇可幫助溶解:對鹼性肽用稀乙酸(含Arg,Lys,His);酸性肽用稀氨水(含Asp,Glu);對極疏水的肽用10%有機修飾物(Acetonitnile,Methanol);極不溶的肽用DM50或DMFguaniclinehydrochloride或脲的濃溶液也很有用,與上述方法合用,聲處理也是溶解多肽的有效手段。

·溶解性

大多數肽的首選溶劑是超純抽氣水。稀乙酸或氨水分別對於鹼性或酸性多肽的溶解很重要。這些方法不溶的多肽,需要DMF、脲、guanidiniamchloride或acetonitnle來溶解,這些溶劑可能某些實驗有副作用。所以我們建議設計多肽時要加註意。

殘基Ala,Cys,Ile,Leu,Met,Phe和Val將全增加多肽的溶解難度。

9 多肽 -多肽的應用——酶法多肽

概況
用生物酶催化蛋白質的方法稱為酶法,用生物酶催化的方法催化蛋白質獲得的多肽叫做「酶法多肽」。

酶法多肽一詞最早起源於1996年,多肽科學家鄒遠東用生物酶催化蛋白質獲得多肽取得了巨大成功。當年,人民日報海外版對外報道這一消息,引起了世界關注,之後得14年內,中國中央主流媒體相繼將鄒遠東作為中國自主創新的重大典型予以報道,2006年《光明日報》以《鄒遠東與他創立的酶法多肽》為題,連續三天進行了專題連續報道;《科技日報》以《鄒遠東自主創新酶法多肽》為題用整版8000字的篇幅報道了鄒遠東;新華社新華網、《人民日報》人民網、中央電視台央視網、中央人民廣播電台中國廣播網、《解放軍報》中國軍網、中國科學院網、中國疾病控制中心網、《中國醫藥報》、《中國知識產權報》均在突出位子重點報道了鄒遠東自主創新酶法多肽的事迹。酶法多肽為此而叫響、為此而成名。

特點


酶法在傳統合成多肽方法的基礎上有所突破和創新,適應了低碳經濟和綠色環保的要求。酶法就是用生物酶催化蛋白質獲得多肽,就是蛋白質降解,人工合成的多肽。酶法較酸法、鹼法、電法溫和、環保。生產工藝簡易,投資少、見效快,適宜工業化生產。酶法獲得多肽,分子量易控制、產品自身富有綠色屬性、生產出來的肽無苦味、肽分子量小(分子量大都在1000以下)、這些小分子肽不需消化直接吸收,具有動力、載體、運輸、遞質和營養功能,特別是它具有極強的活性和多樣性即重要的生物學功能。

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