標籤:生物技術分子化學

層析法是利用不同物質理化性質的差異而建立起來的技術。所有的層析系統都由兩個相組成:一是固定相,另一是流動相。當待分離的混合物隨流動相通過固定相時,由於各組分的理化性質存在差異,與兩相發生相互作用(吸附、溶解、結合等)的能力不同,在兩相中的分配(含量比)不同,且隨流動相向前移動,各組分不斷地在兩相中進行再分配。分部收集流出液,可得到樣品中所含的各單一組分,從而達到將各組分分離的目的。

1英文名稱

chromatographic technique

2定義

利用混合物中各組分的物理化學性質差異,使其以不同速度移動的一種物理分離方法。

3背景

層析技術早在1903年就應用於植物色素的分離提取,各種顏色的色素從上到下在吸附柱上排列成色譜,也稱色譜分離法。1931年有人用氧化鋁柱分離了胡蘿蔔素的兩種同分異構體,顯示了這一分離技術的高度分辨力,從此引起了人們的廣泛注意。隨著人們認識和實踐的提高以及物理化學技術的發展,應用範圍更加廣泛,沒有顏色的物質同樣可用此法分離,這時的工作全是使用吸附劑的吸附層析法。自1944年應用濾紙作為固定支持物的紙層析誕生以來,層析技術的發展越來越快。20世紀50年代開始,相繼出現了氣相層析和高壓液相層析,其他如薄層層析、薄膜層析、親和層析、凝膠層析等也迅速發展。在生物化學領域裡,層析技術已成為一項常用的分離分析方法。

4層析法分類

分配層析技術
各物質在兩相中擴散速度不同,產生不同的分配係數。分配層析分離技術是利用各物質不同分配係數,使混合物隨流動相通過固定相時而予以分離的方法。
分配係數是指一種溶質在兩種互不相溶的溶劑中的溶解達到平衡時,該溶質在兩相溶劑中所具濃度的比例。不同物質因其性質不同而有不同的比例,也就是有不同的分配係數。現在應用的分配層析技術,大多數是以一種多孔物質吸著一種極性溶劑,此極性溶劑在層析過程中始終固定在此多孔支持物上而被稱為固定相。另用一種與固定相不相溶的非極性溶劑流過固定相,此移動溶劑稱為流動相。如果有多種物質存在於固定相和流動相之間,將隨著流動相的移動進行連續的、動態的不斷分配,由於各種物質的分配係數相近,移動距離就必須相當長才能分開。反之,兩種物質的分配係數相差越大,彼此分開時的移動距離就越短。因此,必須根據實際情況,選定作為固定相用的層析柱或濾紙的長度。
分配層析中應用最廣泛的是以濾紙為多孔支持物的紙上分配層析。其次是以硅膠、硅藻土、纖維素粉、澱粉、微孔聚乙烯粉等多孔支持物的分配層析。還有直接使物質在兩種不相溶的溶劑中進行分配的常壓液相分配層析和高壓液相分配層析。
分配層析以分配係數為依據,在等溫等壓條件下可用下式表示。K=K2/K1,式中K為分配係數;K2是物質在固定相中的濃度; K1是物質在流動相中的濃度。分配係數與溫度、溶質和溶劑的性質有關,各種物質有不同的分配係數。
薄層層析分離技術
將作為固定相的支持劑 (吸附劑或其它)塗於支持板上(一般為玻璃板) 進行的一種層析技術。如果支持劑是吸附劑,層析時的主要依據是吸附力的不同,應屬吸附層析,又因此種吸附層析是在薄板上進行,故名薄層吸附層析。如果支持劑是纖維素,其層析的主要依據是分配係數的不同,應屬分配層析,因在薄板上進行,故名薄層分配層析。同理,薄板上塗以離子交換劑,分離作用的主要依據為離子交換而名薄層離子交換層析; 薄板上塗以凝膠過濾劑,分離作用主要依據為分子量的大小,而名薄層凝膠層析。
特點
各種薄層層析的原理與其對應的柱層析原理相同,但比其相應的柱層析具有更多的優越性。它同柱層析一樣,可選擇不同的支持劑和不同的處理方法進行薄層層析,它保持了操作方便、設備簡單、顯色容易等特點。同時,層析速度快,一般僅需15~20分鐘,混合物易分離,分辨力一般比紙上層析高10倍,甚至100倍,它既適用於只有0.01微克(一般用幾十微克)的樣品分離,又能分離大於500毫克的樣品作製備用,而且可以使用如濃硫酸、濃鹽酸之類的腐蝕性顯色劑。由於薄層製備利於規格化,重現性也較好,滴加樣品后可立即展層,不受溫度等影響,因此發展較快,應用較廣。缺點是對生物高分子物質的分離效果仍然不佳。
氣相層析
也稱氣相色譜。它與一般層析法的區別主要在於用氣體代替液體作為擴展劑或洗脫劑,因此也同樣有吸附氣體層析法(氣固層析法)和分配氣體層析法(氣液層析法)兩種操作形式。實際應用中以後者為常用。
背景
氣液層析法自1952年發表以來發展迅速,目前已形成了一門獨立的分離分析技術,其應用範圍自石油化學部門擴展到有機、生化、高分子、藥物、無機等領域,凡是可以汽化的或設法保持有揮發性的物質幾乎都可分析。
特點
①氣體粘度小,氣相與液相(固定相)間的質量傳遞率高,容易達到平衡,當使用高的氣相流速時可縮短分離時間,分析常在幾分鐘到幾十分鐘內完成,使用長的層析管能提高分離效率;②檢定氣體中的組分比檢定液體中的組分容易,已有許多簡單與靈敏的儀器可以利用,並可設法使檢定工作自動化,節省人力和時間,它也可與紅外、質譜等組合以提高分析效果; ③氣液層析法中固定相液體的選擇範圍很廣,操作溫度範圍也很寬,兩者配合,可將結構相似或沸點相近的物質分開;④檢定器靈敏,樣品用量很少,一般固體樣品只需若干μg至mg;液體樣品量1μl至幾百μl;氣體樣品0.1 ml至10ml。
混合物樣品隨固定流速的載體(常用惰性氣體)進入層析柱。樣品必須是氣態的,如為液態或固態則需先氣化再進入層析柱。層析柱內裝有稱為擔體(樹脂)的顆粒狀隋性支持物,其表面為一類具有高沸點的有機化合物(稱固定液)均勻地包裹著,使擔體表面形成一層很薄的液膜。樣品氣體進入層析柱遇到這種固定液時,就能溶解在固定液中,遇熱又能揮發到載體里去,並隨載體的定向流動而向前推進,以至又遇到新的固定液而被吸收。如此交替地吸收和揮發,使樣品蒸汽所經過的每一個點上都進行著固定相和流動相之間的分配平衡,由於樣品中各組分在固定液和流動相里的溶解度不同(即分配係數不同),在層析柱內向前移動的速度也不相同。分配係數大的組分,易溶於固定液內,在固定液中停留的時間就長些,移動的速度也就慢些,分配係數小的組分不易溶於固定液,移動速度就快。經過一段時間后,原來均勻混合的樣品組分彼此就分開了,被分離的組分按先後次序被載體帶入鑒定器,在那裡把進入的樣品濃度轉換成電壓,經放大后在自動記錄儀上記錄下來,得到氣相層析曲線圖。從給樣到每一組分出現在層析峰上的時間稱保留時間,不同化合物在一定條件下有其特定的保留時間。還可根據峰面積來計算各種化合物的濃度。

高壓液體層析

又稱高效液相層析(或色譜)。其分離分析原理和經典的液體層析基本相同,但它採用了特有的固定相液體,加上在高壓下工作,又與自動分析儀器相結合,成為一種高效的分析方法。廣泛用於藥物、殺蟲劑、高分子量芳香族化合物、增塑劑、抗生素、各種有機試劑以及核酸、核苷酸類物質的分離分析。
高壓液體層析特點是採用長 (50~100cm) 而細(柱徑2~3mm)的層析柱,柱內填充物的粒度較細(直徑10~15μm),在高壓下操作,因而分析速度很快。一般可分為以下4類:①液-液分配層析。利用溶質在流動相中分配係數的差別而達到分離的目的,是應用最多的方法之一; ②液-固吸附層析。利用溶質在固體吸附劑上吸附能力的差別,而達到分離目的; ③離子交換層析。通過溶質和擔體的離子交換作用,利用不同溶質離子交換能力的差別,而達到分離目的;④凝膠滲透層析。按溶質分子量大小而分離,也即分子篩層析。
高壓液體層析中常用的擔體是聚苯乙烯凝膠、多孔性二氧化硅微球、多孔玻璃珠等,這些層析擔體對高分子化合物及表面活性劑的分離很有效。
而按層析原理還可將層析分為:
1.凝膠層析:又稱分子篩過濾或排阻層析等。醫學教育網搜集整理固定相是多孔凝膠,各組分的分子大小不同,因而在凝膠上受阻滯的程度也不同。本法的優點是所用凝膠屬於惰性載體,吸附力弱,操作條件溫和,不需要有機溶劑,對高分子物質有很好的分離效果。常用的凝膠有Sephadex G系列。凝膠層析可用於脫鹽、分離提純、測定高分子物質的分子量、高分子溶液的濃縮等。
2.離子交換層析:採用具有離子交換性能的物質作固定相,利用它與流動相中的離子能進行可逆交換的性質來分離離子型化合物的方法。主要用於分離氨基酸、多肽及蛋白質,也可用於分離核酸、核苷酸及其他帶電荷的生物分子。
3.高效液相層析(HPLC):在經典液相層析法基礎上,引進氣相層析的理論而發展起來的一項新穎快速的分離技術。具有分離能力強、測定靈敏度高、可在室溫下進行、應用範圍廣等優點,對分離蛋白質、核酸、氨基酸、生物鹼、類固醇和類脂等尤其有利,根據流動相和固定相相對極性,高效液相色譜分析可分為正相和反相兩種。
4.親和層析:利用待分離物質和它的特異性配體間具有特異的親和力,從而達到分離的目的。將可親和的一對分子中的一方以共價鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑,當含混合組分的樣品通過此固定相時,只有和固定相分子有特異親和力的物質,才能被固定相吸附結合,性無關組分隨流動相流出。改變流動相組分,可將結合的親和物洗脫下來。親和層析中所用的載體稱為基質,與基質共價連接的化合物稱配基。具有專一親和力的生物分子對主要有:抗原與抗體,DNA與互補DNA或RNA,酶與底物、激素與受體、維生素與特異結合蛋白、糖蛋白與植物凝集素等。親和層析可用於純化生物大分子、稀釋液的濃縮、不穩定蛋白質的貯藏、分離核酸等。

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