標籤:生物化學 基因工程

基因工程涉及眾多的工具酶可粗略的分為限制酶,連接酶,聚合酶和修飾酶四大類。其中,以限制性核酸內切酶和DNA連接酶在分子克隆中的作用最為突出。

1DNA限制性內切酶:

生物體內能識別並切割特異的雙鏈DNA序列的一種內切核酸酶。它是可以將外來的DNA切斷的酶,即能夠限制異源DNA的侵入並使之失去活力,但對自己的DNA卻無損害作用,這樣可以保護細胞原有的遺傳信息。由於這種切割作用是在DNA分子內部進行的,故名限制性內切酶(簡稱限制酶)
限制性內切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA內切酶之分,Ⅱ型能嚴格識別核酸序列,並在識別區內特定的核苷酸處切開DNA雙鏈。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA內切酶。識別分四核苷酸,五核苷酸,八核苷酸和六核苷酸,其中以六核苷酸為主,其序列旋轉對稱。切口分黏性末端和平末端,產生3′-OH和5′-P末端。內切酶品種多,使用時應注意溫度、緩衝液用量(一般1μg DNA/2-5單位酶)等反應條件。

2連接酶:

它是一種封閉DNA鏈上缺口酶,藉助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結合的(T4DNA連接酶除外),而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。
連接酶有T4噬菌體DNA連接酶、T4噬菌體RNA連接酶、大腸埃希菌DNA連接酶等。DNA連接酶可連接平端,也連接粘端。反應需有Mg2+和ATP存在,pH7.5-7.6。最適溫度37℃,30℃以下活性明顯下降,但考慮到被連接DNa 的穩定性和粘性末端的退火溫度,一般平端連接用20-25℃,粘端連接用12℃左右。
聚合酶有DNA聚合酶(以DNA為模板合成DNA大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ,大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow大片段),T4或T7噬菌體DNA聚合酶等);RNA聚合酶(以DNA為模板合成RNA,T7或T3噬菌體RNA聚合酶);逆轉錄酶(以RNA為模板合成DNA,除RNA病毒中發現外,發現大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有逆轉錄活性)。
大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′,3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草桿菌酶作用產生的一個大片段,有5′→3′聚合酶和3′→5′外切酶活性,無5′→3′外切酶活性。可用於缺口翻譯(Nick translation)法標記核酸,也可用於DNA序列測定,修補DNA鏈等。

3聚合酶:

又稱DNA聚合酶。系專司生物催化合成脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的一類酶的統稱。
可分為以下幾個類群:(1)依賴DNA的DNA聚合酶;(2)依賴RNA的DNA聚合酶;(3)依賴DNA的RNA聚合酶;(4)依賴RNA的RNA聚合酶。前兩者是DNA聚合酶,它使DNA複製鏈按模板順序延長。如在原核生物中僅就大腸桿菌中已被發現的就有三種(分別簡稱為P01Ⅰ,P01Ⅱ和P01Ⅲ等);DNA聚合酶只能在有引物的基礎上,即在DNA或RNA引物的3′-OH延伸,這DNA的合成方向記為5′→3′。換言之DNA聚合酶催化反應除底物(αNTP)外,還需要Mg2+、模板DNA和引物,迄今細胞內尚無發現可從單體起始DNA的合成。同樣,上述(3)和(4)是催化RNA生物合成反應中最主要的RNA合成酶,它們以四種三磷酸核糖核苷(NTP)為底物,並需有DNA模板以及Mn2+及Mg2+的存在下,在前一個核苷酸3′-OH與下一個核苷酸的5′-P聚合形成3′,5′-磷酸二酯鍵,其新生鏈的方向也是5′→3′。RNA聚合酶也大量存在於原核和真核生物的細胞中。如大腸桿菌RNA聚合酶分子量4.8×105,由5條多肽鏈組成,分別命名為α,α,β,β′,和γ,全酶可用α2ββ′λ表示。真核生物RNA聚合酶分子大於5×105,由10~12個大小不等亞基組成。聚合酶除作為自然界生命活動中不可缺少的組分外,在實驗室中大多用作生命科學研究的工具酶類之一。

4核酸酶:

核酸酶有DNase、RNase、核酸酶S1等,可水解相應的DNA和RNA,核酸酶S1可降解單鏈DNA和RNA,用量增大也可降解雙鏈核酸。它可用於切去ds-cDNA合成中產生的髮夾環。
末端轉移酶在Mg2+存在下,選擇3′-OH端單鏈DNA為引物加成核苷酸,在Co2+存在下,選擇3′-OH端雙鏈DNA為引物加成核苷酸,形成多聚核苷酸尾。常用於核酸末端標記和核酸連接的互補多聚尾(連接器)。

5修飾酶:

體內有些酶可在其他酶的作用下,將酶的結構進行共價修飾,使該酶活性發生改變,這種調節稱為共價修飾調節(covalent modification regulation),這類酶稱為修飾酶(prosessing enzyme)。
鹼性磷酸酶去除5′-P,可防止二分子DNA片段5′端P基團自身空間障礙,影響DNA分子之間的連接,一般用鹼性磷酸酶處理載體DNA除去5′端P基團,在連接酶作用下目的基因的5′端P先與載體3′端OH連接,再通過複製修復另一條鏈,使二條鏈完全連接。該方法大大提高了連接效率。

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