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微生物限度檢查法

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  微生物限度檢查法系檢查非規定滅菌製劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括細菌數、黴菌數、酵母菌數及控制菌檢查。微生物限度檢查應在環境潔凈度10000 級下的局部潔凈度100 級的單向流空氣區域內進行。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作,防止再污染。單向流空氣區域、工作檯面及環境應定期按《醫藥工業潔凈室(區)懸浮粒子、浮遊菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔凈度驗證。供試品檢查時,如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑,應證明其有效性及對微生物無毒性。

  除另有規定外,本檢查法中細菌及控制菌培養溫度為30℃~35℃;黴菌、酵母菌培養溫度為23℃~28℃。檢驗結果以1g、1ml、10g、10ml、10c㎡ 為單位報告,特殊品種可以最小包裝單位報告。

1 微生物限度檢查法 -檢驗量

  檢驗量即一次試驗所用的供試品量(g、ml 或c㎡)。除另有規定外,一般供試品的檢驗量為10g 或10ml;膜劑為100c㎡;貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品,其檢驗量應增加20g 或20ml(其中10g 用於陽性對照試驗)。檢驗時,應從2 個以上最小包裝單位中抽取供試品,大蜜丸還不得少於4丸,膜劑還不得少於4 片。一般應隨機抽取不少於檢驗用量(兩個以上最小包裝單位)的3 倍量供試品。供試液的製備根據供試品的理化特性與生物學特性,採取適宜的方法製備供試液。供試液製備若需加溫時,應均勻加熱,且溫度不應超過45℃。供試液從製備至加入檢驗用培養基,不得超過1 小時。除另有規定外,常用的供試液製備方法如下。

1.液體供試品

  取供試品10ml,加pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液至100ml,混勻,作為1∶10 的供試液。油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80 使供試品分散均勻。水溶性液體製劑也可用混合的供試品原液作為供試液。

2.固體、半固體或黏稠性供試品

  取供試品10g,加pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液至100ml,用勻漿儀或其他適宜的方法,混勻,作為1∶10 的供試液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80,並置水浴中適當加溫使供試品分散均勻。

  3.需用特殊供試液製備方法的供試品

  
(1)非水溶性供試品

  方法1 取供試品5g(或5ml),加至含溶化的(溫度不超過45℃)5g 司盤80、3g 單硬脂酸甘油酯、10g 聚山梨酯80 無菌混合物的燒杯中,用無菌玻棒攪拌成團后,慢慢加入45℃的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液至100ml,邊加邊攪拌,使供試品充分乳化,作為1∶20 的供試液。

  方法2 取供試品10g,加至含20ml 無菌十四烷酸異丙酯和無菌玻璃珠的適宜容器中,必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量,充分振搖,使供試品溶解。然後加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液100ml,振搖5~10 分鐘,萃取,靜置使油水明顯分層,取其水層作為1∶10 的供試液。

  (2)膜劑供試品

  取供試品100c㎡,剪碎,加100ml 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液(必要時可增加稀釋液),浸泡,振搖,作為1∶10 的供試液。

  (3)腸溶及結腸溶製劑供試品

  取供試品10g,加pH6.8 無菌磷酸鹽緩衝液(用於腸溶製劑)或pH7.6 無菌磷酸鹽緩衝液(用於結腸溶製劑)至100ml,置45℃水浴中,振搖,使溶解,作為1∶10 的供試液。

  (4)氣霧劑、噴霧劑供試品

  取規定量供試品,置冰凍室冷凍約1 小時,取出,迅速消毒供試品開啟部位,用無菌鋼錐在該部位鑽一小孔,放至室溫,並輕輕轉動容器,使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液,加至適量的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液(若含非水溶性成分,加適量的無菌聚山梨酯80)中,混勻,取相當於10g或10ml 的供試品,再稀釋成1∶10 的供試液。

  (5)貼膏劑供試品

  取規定量供試品,去掉貼膏劑的保護層,放置在無菌玻璃或塑料片上,粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料(如無菌紗布)覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然後將其置於適宜體積並含有表面活性劑(如聚山梨酯80 或卵磷脂)的稀釋劑中,用力振蕩至少30 分鐘,製成供試液。貼膏劑也可以其他適宜的方法製備成供試液。

  (6)具抑菌活性的供試品

  當供試品有抑菌活性時,採用下列方法進行處理,以消除供試液的抑菌活性后,再依法檢查。常用的方法如下。

  ①培養基稀釋法 取規定量的供試液,至較大量的培養基中,使單位體積內的供試品含量減少,至不含抑菌作用。測定細菌、黴菌及酵母菌的菌數時,取同稀釋級的供試液2ml,每1ml 供試液可等量分注多個平皿,傾注瓊脂培養基,混勻,凝固,培養,計數。每1ml 供試液所注的平皿中生長的菌數之和即為1ml的菌落數,計算每1ml 供試液的平均菌落數,按平皿法計數規則報告菌數;控制菌檢查時,可加大增菌培養基的用量。

  ② 離心沉澱法 取一定量的供試液, 500 轉/分離心3 分鐘,取全部上清液混合,用於細菌檢查。

  ③薄膜過濾法 見細菌、黴菌及酵母菌計數項下的「薄膜過濾法」。

  ④中和法 凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品,可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養基中。

2 微生物限度檢查法 -試驗用菌種

  細菌、黴菌及酵母菌計數計數培養基的適用性檢查細菌、黴菌及酵母菌計數用的培養基應進行培養基的適用性檢查,成品培養基、由脫水培養基或按培養基處方配製的培養基均應檢查。菌種試驗用菌株的傳代次數不得超過5 代(從菌種保存中心獲得的冷凍乾燥菌種為第0 代)。應採用適宜的菌種保藏技術進行保存,以保證試驗菌株的生物學特性。

  大腸埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC(B) 44 102〕

  金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕

  枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)〔CMCC(B) 63 501〕

  白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕

  黑麴黴(Aspergillus niger)〔CMCC(F) 98 003〕

3 微生物限度檢查法 -菌液製備

  接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基或營養瓊脂培養基中,培養18~24 小時;接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基或改良馬丁瓊脂培養基中,培養24~48 小時。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml 含菌數為50~100cfu 的菌懸液。接種黑麴黴的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中,培養5~7 天,加入3~5ml 含0.05%(v/v)聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫。然後,用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內,用含0.05%(v/v)聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml 含孢子數50~100cfu 的孢子懸液。菌懸液在室溫下放置應在2 小時內使用,若保存在2~8℃可在24 小時內使用。黑麴黴孢子懸液可保存在2~8℃,在驗證過的貯存期內使用。適用性檢查 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各50~100cfu,分別注入無菌平皿中,立即傾注營養瓊脂培養基,每株試驗菌平行製備2 個平皿,混勻,凝固,置30~35℃培養48 小時,計數;取白色念珠菌、黑麴黴各50~100cfu,分別注入無菌平皿中,立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基,每株試驗菌平行製備2個平皿,混勻,凝固,置23~28℃培養72 小時,計數;取白色念珠菌50~100cfu,注入無菌平皿中,立即傾注酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基,平行製備2 個平皿,混勻,凝固,置23~28℃培養72 小時,計數。同時,用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗。

4 微生物限度檢查法 -結果判定

  被檢培養基上的菌落平均數與對照培養基上的菌落平均數的比值大於70%,且菌落形態大小應與對照培養基上的菌落一致。判該培養基的適用性檢查符合規定。計數方法的驗證當建立產品的微生物限度檢查法時,應進行細菌、黴菌及酵母菌計數方法的驗證,以確認所採用的方法適合於該產品的細菌、黴菌及酵母菌數的測定。若產品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時,計數方法應重新驗證。驗證時,按供試液的製備和細菌、黴菌及酵母菌計數所規定的方法及下列要求進行。對各試驗菌的回收率應逐一進行驗證。菌種及菌液製備 同計數培養基的適用性檢查驗證方法 驗證試驗至少應進行3 次獨立的平行試驗,並分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。

  (1)試驗組 平皿法計數時,取試驗可能用的最低稀釋級供試液1ml 和50~100cfu 試驗菌,分別注入平皿中,立即傾注瓊脂培養基,每株試驗菌平行製備2個平皿,按平皿法測定其菌數。薄膜過濾法計數時,取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液,過濾,沖洗,在最後一次的沖洗液中加入50~100cfu 試驗菌,過濾,按薄膜過濾法測定其菌數。

  (2)菌液組 測定所加的試驗菌數。

  (3)供試品對照組 取規定量供試液,按菌落計數方法測定供試品本底菌數。

  (4)稀釋劑對照組 若供試液製備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時,應增加稀釋劑對照組,以考察供試液製備過程中微生物受影響的程度。試驗時,可用相應的稀釋液替代供試品,加入試驗菌,使最終菌濃度為每1ml 供試液含50~100cfu,按試驗組的供試液製備方法和菌落計數方法測定其菌數。結果判斷 在3 次獨立的平行試驗中,稀釋劑對照組的菌回收率(稀釋劑對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率)應均不低於70%。若試驗組的菌回收率(試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數的值占菌液組的平均菌落數的百分率)均不低於70%,照該供試液製備方法和計數法測定供試品的細菌、黴菌及酵母菌數;若任一次試驗中試驗組的菌回收率低於70%,應採用培養基稀釋法、離心沉澱法、薄膜過濾法、中和法(表1)等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性,並重新進行方法驗證。表1 常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物 可選用的中和劑或滅活方法戊二醛 亞硫酸氫納酚類、乙醇、吸附物 稀釋法醛類 稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽季銨類化合物(QACs)、對羥基苯甲酸酯、 卵磷脂、聚山梨酯汞類製劑 亞硫酸氫納、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽雙胍類化合物 卵磷脂酒、洗必泰類 聚山梨酯鹵化物 硫代硫酸鹽 乙二胺四乙酸(EDTA) 鎂或鈣離子磺胺類 對氨基苯甲酸。

  若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用,那麼驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的,同時表明該供試品不能被試驗菌污染。但是,供試品也可能僅對試驗用菌株具有抑制作用,而對其他菌株沒有抑制作用。因此,根據供試品須符合的微生物限度標準和菌數報告規則,在不影響檢驗結果判斷的前提下,應採用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法驗證試驗。若驗證試驗符合要求,應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢驗。計數方法驗證時,採用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求,那麼選擇回收情況最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢驗。驗證試驗也可與供試品的細菌、黴菌及酵母菌計數同時進行。

供試品檢查

  計數方法包括平皿法和薄膜過濾法。檢查時,按已驗證的計數方法進行供試品的細菌、黴菌及酵母菌菌數的測定。控制菌檢查方法的驗證當建立藥品的微生物限度檢查法時,應進行控制菌檢查方法的驗證,以確認所採用的方法適合於該藥品的控制菌檢查。若藥品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時,檢查方法應重新驗證。驗證時,依各品種項下微生物限度標準中規定檢查的控制菌選擇相應驗證的菌株,驗證大腸菌群檢查法時,應採用大腸埃希菌作為驗證菌株。驗證試驗按供試液的製備和控制菌檢查法的規定及下列要求進行。菌種及菌液製備 同控制菌檢查用培養基的適用性檢查 。

驗證方法

  取規定量供試液及10~100cfu 試驗菌加入增菌培養基中,依相應控制菌檢查法進行檢查。當採用薄膜過濾法時,取規定量供試液,過濾,沖洗,試驗菌應加在最後一次沖洗液中,過濾后,注入增菌培養基或取出濾膜接入增菌培養基中。結果判斷 若上述試驗檢出試驗菌,按此供試液製備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查;若試驗組未檢出試驗菌,應採用培養基稀釋法、離心沉澱集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性,並重新進行方法驗證。驗證試驗也可與供試品的控制菌檢查同時進行。供試品檢查供試品的控制菌檢查應按已驗證的方法進行,增菌培養基的實際用量同控制菌檢查方法的驗證。陽性對照試驗 供試品進行控制菌檢查時,應做陽性對照試驗。陽性對照試驗的加菌量為10~100cfu,方法同供試品的控制菌檢查。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌。陰性對照試驗 取稀釋液10ml 照相應控制菌檢查法檢查,作為陰性對照。陰性對照應無菌生長。

5 微生物限度檢查法 -微生物限度標準

  非無菌藥品的微生物限度標準是基於藥品的給葯途徑和對患者健康潛在的危害以及中藥的特殊性而制訂的。藥品的生產、貯存、銷售過程中的檢驗,中藥提取物及輔料的檢驗,新葯標準制訂,進口藥品標準複核,考察藥品質量及仲裁等,除另有規定外,其微生物限度均以本標準為依據。

  1.製劑通則、品種項下要求無菌的製劑及標示無菌的製劑 應符合無菌檢查法規定。

  2.口服給葯製劑

  2.1 不含藥材原粉的製劑

  細菌數 每1g 不得過1000cfu。每1ml 不得過100cfu。黴菌和酵母菌數 每1g 或1ml 不得過100cfu。大腸埃希菌 每1g 或1ml 不得檢出。

  2.2 含藥材原粉的製劑

  細菌數 每1g 不得過10 000cfu(丸劑每1g 不得過30 000cfu)。每1ml不得過500cfu。黴菌和酵母菌數 每1g 或1ml 不得過100cfu。大腸埃希菌 每1g 或1ml 不得檢出。大腸菌群 每1g 應小於100 個。每1ml 應小於10 個。

  2.3 含豆豉、神曲等發酵原粉的製劑

  細菌數 每1g 不得過100000cfu。每1ml 不得過1000cfu。

  黴菌和酵母菌數 每1g 不得過500cfu。每1ml 不得過100cfu。

  大腸埃希菌 每1g 或1ml 不得檢出。

  大腸菌群 每1g 應小於100 個。每1ml 應小於10 個。

  3.局部給葯製劑

  3.1 用於手術、燒傷或嚴重創傷的局部給葯製劑 應符合無菌檢查法規定。

  3.2 用於表皮或黏膜不完整的含藥材原粉的局部給葯製劑

  細菌數 每1g 或10cm2 不得過1000cfu。每1ml 不得過100cfu。

  3.3 用於表皮或黏膜完整的含藥材原粉的局部給葯製劑

  細菌數 每1g 或10cm2 不得過10 000cfu。每1ml 不得過100cfu。

  3.4 眼部給葯製劑

  細菌數 每1g 或1ml 不得過10cfu。

  黴菌和酵母菌數 每1g 或1ml 不得檢出。

  金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌 每1g 或1ml 不得檢出。

  3.5 耳、鼻及呼吸道吸入給葯製劑

  細菌數 每1g、1ml 或10cm2 不得過100cfu。。

  3.6 陰道、尿道給葯製劑

  細菌數 每1g、1ml 或10cm2 不得過100cfu。

  黴菌和酵母菌數 每1g、1ml 或10cm2 應小於10cfu。

  3.7 直腸給葯製劑

  細菌數 每1g 不得過1000 個。每1ml 不得過100cfu。

  黴菌和酵母菌數 每1g 或1ml 不得過100cfu。

  金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌 每1g 或1ml 不得檢出。

  3.8 其他局部給葯製劑

  細菌數 每1g、1ml 或10cm2 不得過100cfu。

  黴菌和酵母菌數 每1g、1ml 或10cm2 不得過100cfu。

  金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌 每1g、1ml 或10cm2 不得檢出。

  4.含動物臟器(包括提取物)及動物類原藥材粉(蜂蜜、王漿、動物角、阿

  膠除外)的口服給葯製劑 每10g 或10ml 還不得檢出沙門菌。

  5.有兼用途徑的製劑 應符合各給葯途徑的標準。

  6.霉變、長蟎者 以不合格論。

  7.中藥提取物及輔料 參照相應製劑的微生物限度標準執行。

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