標籤:臨床微生物

用於測定抗菌藥物體外抑制細菌生長效力的試驗稱為抑菌試驗。通過抑菌實驗,可以測定一個藥物的最低抑菌濃度,用以評價該藥物的抑菌性能,這是抗菌藥物的最基本的藥效學數據。主要方法有進行定性測定的擴散法(如抑菌斑試驗)和進行定量測定的稀釋法(如最低抑菌濃度實驗)。

1簡介

用於測定抗菌藥物體外抑制細菌生長效力的試驗稱為抑菌試驗。通過抑菌實驗,可以測定一個藥物的最低抑菌濃度,用以評價該藥物的抑菌性能,這是抗菌藥物的最基本的藥效學數據。主要方法有進行定性測定的擴散法(如抑菌斑試驗)和進行定量測定的稀釋法(如最低抑菌濃度實驗)。

2常用方法

微量肉湯稀釋法
A、抗菌藥物和培養基製備
1.2.1.抗菌藥物和培養基製備 同常量肉湯稀釋法。
B、MIC板製備
1.2.2.MIC板製備 無菌操作,將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中,第1至第11孔加藥液,每孔10μl,第12孔不加藥作為生長對照,冰凍乾燥后密封,-20℃以下保存備用。
C、接種物製備
1.2.3.接種物製備 將用生長法或直接菌懸液法製備的濃度相當於0.5麥氏比濁標準的菌懸液,經MH肉湯1∶1000稀釋后,向每孔中加100μl,密封後置35℃普通空氣孵箱中,孵育16~20h判斷結果。當試驗嗜血桿菌屬,鏈球菌屬時,孵育時間為20~24h,試驗葡萄球菌和腸球菌對苯唑西林和萬古黴素的葯敏試驗時孵育時間必須滿24h。此時,第1孔至第11孔藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。
D、結果判斷
1.2.4.結果判斷 以在小孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。當陽性對照孔(即不含抗生素)內細菌明顯生長試驗才有意義。當在微量肉湯稀釋法出現單一的跳孔時,應記錄抑制細菌生長的最高藥物濃度。如出現多處跳孔,則不應報告結果,需重複試驗。通常對革蘭陰性桿菌而言,微量肉湯稀釋法測得的MIC與常量肉湯稀釋法測得的結果相同或低一個稀釋度(1孔或2倍)。
紙片擴散法
紙片擴散法(K-B法)又稱瓊脂擴散法
K-B法葯敏試驗時接種物配製有兩種方法。
第一種是肉湯增菌法(對數生長法),是用接環挑取3-5個細菌菌落入肉湯增菌管中進行增菌4-6小時,然後用生理鹽水或肉湯對增菌管中的培養物進行稀釋校正使其濃度達到0.5麥氏比濁標準(因為經過增菌培養其培養物濃度一般都高於此標準)。
第二種方法是直接菌落法:從孵育18-24小時的非選擇性培養基上,挑取3-5菌落,直接用肉湯或鹽製成懸液作為接種,然後將濁度調整至0.5麥氏比濁標準。此法是檢測苛養菌(如嗜血桿菌、淋病奈瑟菌和鏈球菌)和潛在的對甲氧西林耐葯的葡萄球菌的推薦方法。
將菌製成菌懸液用無菌棉簽蘸取菌液在管壁上擠去多餘菌液 ,塗布整個M2H平板表面 ,反覆 3 次 ,每次將平板旋轉60 度 ,保證塗布均勻 ,35 ℃培養后菌落呈半融合狀態 ,否則影響葯敏結果。
K-B 法指定用 M-H瓊脂平板 ,應用直徑90cm平皿 ,在水平的無菌台上傾倒 ,準確量取高壓滅菌后的M2H瓊脂液25ml ,使之瓊脂板厚度為 4mm。否則厚度過高 ,使含藥物紙片的藥物半球形擴散的體積加大 ,導致假耐葯;反之導致假敏感。
要求紙片直徑 6.00~6.35mm每片吸水量約012 μl ,紙片的藥物含量必須與 K 2B 法規定的
一致 ,用前必須做質量鑒定 ,質量合格方可使用。紙片的保存尤為重要 ,一般要求保存在有乾燥劑的容器內低溫保存 ,紙片取出后須放室溫10min後方可打開 ,否則空氣中的水份冷凝在紙片上易潮解 ,使藥物失效影響葯敏試驗結果。

E試驗

E試驗是指濃度梯度瓊脂擴散試驗,其原理基本同擴散法,即濃度呈連續梯度的抗菌藥物從塑料試條中向瓊脂中擴散,在試條周圍抑菌濃度範圍內受試菌的生長被抑制,從而形成透明的抑菌圈。E試驗綜合了稀釋法和擴散法的原理和特點,同時還彌補了二者的一些不足,可以像稀釋法一樣直接定量測出抗菌藥物對受試菌的MIC。
A、培養基、菌液製備和接種
3.1.培養基、菌液製備和接種 同紙片擴散法。
B、貼E試驗條
3.2.貼E試驗條 同紙片擴散法,E試驗條的刻度面朝上,不得貼反,一旦接觸瓊脂后不得再移動。直徑150mm的平皿內可放置6根E試驗試條,90mm者一般只能放置1根。
C、孵育時間和溫度
3.3.孵育時間和溫度 同紙片擴散法。
D、結果閱讀
3.4.結果閱讀 孵育后圍繞試條可形成一個橢圓形的抑菌圈,在抑菌圈和試條的橫切相交處試條上的讀數刻度即是測定抗菌藥物對受試菌的MIC。閱讀時應注意的問題見供應商的產品說明書。

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