評論(0

抗原抗體反應

標籤: 暫無標籤

1生物學定義

指抗原與相應抗體之間所發生的特異性結合反應。
抗原抗體反應曲線

  抗原抗體反應曲線

這種反應即可在機體內進行,也可以在機體外進行。抗原抗體反應的過程是經過一系列的化學和物理變化,包括抗原抗體特異性結合和非特異性促凝聚兩個階段,以及由親水膠體轉為疏水膠體的變化。

2特點

抗原抗體反應的特點主要有三性:即特異性、比例性、可逆性。
抗原抗體反應曲線特點

  抗原抗體反應曲線特點

特異性。是抗原抗體反應的最主要特徵,這種特異性是由抗原決定簇和抗體分子的超變區之間空間結構的互補性確定的。這種高度的特異性在傳染病的診斷與防治方面得到有效的應用。隨著免疫學技術的發展進步,還將在醫學和生物學領域得到更加深入和廣泛的應用,比如腫瘤的診斷和特異性治療等。
比例性。是指抗原與抗體發生可見反應需遵循一定的量比關係,只有當二者濃度比例適當時才出現可見反應,在抗原抗體比例相當或抗原稍過剩的情況下,反應最徹底,形成的免疫複合物沉澱最多、最大。而當抗原抗體比例超過此範圍時,反應速度和沉澱物量都會迅速降低甚至不出現抗原抗體反應。
可逆性。是指抗原抗體結合形成複合物后,在一定條件下又可解離恢復為抗原與抗體的特性。由於抗原抗體反應是分子表面的非共價鍵結合,所形成的複合物並不牢固,可以隨時解離,解離后的抗原抗體仍保持原來的理化特徵和生物學活性。

3應用

免疫動物
(1)抗原:免疫動物是製備抗血清的第—步。免疫所用的抗原可用病毒、細菌或者其他蛋白質抗原,如果使用半抗原如小分子激素等,必須與大分子載體連接。抗原的用量視抗原種類及動物而異,—次注射小鼠可以少至幾個微克,免、羊甚至更大的動物每次注射的量就相應增加,從幾百μg/次至幾mg/次。
〔2)佐劑及乳化:佐劑可以幫助抗原在注射部位緩慢釋放,以增加免疫刺激的效果。佐劑有完全和不完全佐劑之分。完全佐劑加有滅活的分枝桿菌(如卡介苗)或棒狀桿菌。福氏佐劑可從試劑公司購買,也可用羊毛脂和石蠟油按1:2—4混合自行製備。佐劑與抗原按1:1的比例混合乳化為均勻的乳液,放置后不會發生油水分離。
(3)免疫動物:常用於製備抗血清的動物打豚鼠、家免、小鼠、大鼠等,如果大量生產可用動物羊、馬等,動物接受免疫的乳液量小鼠為1.0—2.0 mL,家兔為2—4mL。抗原免疫動物的途徑取決於動物種類、抗原特性和是否使用佐劑。腹腔注射(i.p),肌肉注射(i.m),皮內注射(i.d.)和皮下注射(s.c.)適合於任何抗原,這些途徑主要刺激局部淋巴結髮生免疫應答,初次免疫和免疫加強注射均可使用。靜脈注射(i.v.)則只適合於可溶性抗原及分散的單細胞懸液,且不能使用佐劑,其誘發的免疫應答主要發生在脾臟。此外,在單克隆抗體製備時,亦可用脾臟直接注射或體外免疫方法,尤其對微量抗原比較實用。體外免疫方法也常用於人源單克隆抗體的製備。體外免疫時將脾細胞或外周血淋巴細胞(包括B細胞,T細胞及抗原遞呈細胞)與抗原一起作體外培養,然後再與骨髓瘤細胞融合。初次免疫后要經過2—3次以上的免疫加強以保證能形成較高水平的IgC抗體。兩次免疫注射之間的時間間隔,一般3—4周比較適合大部分動物,小動物可間隔10—14d,大動物則在2月左右。在免疫加強最後一次注射后的一周內採集抗血清,可獲得高水平的抗體。
抗血清的特性鑒定
根據不同目的製備的抗血清,對其中所含抗體的濃度,特異性及免疫球蛋白種類的要求也不一樣。為了獲得質量和數量上合符要求的抗血清,在收集動物血清前必須對免疫效果進行檢測,對收穫后的抗血清也必須對—些參數進行分析,如效價、親和力及交叉反應等。根據不同的抗原性質選用合適的檢測方法。最常用的為免疫沉澱,ELISA,放射免疫等。
效價又稱滴度(titer),是常用於表達抗血清中特異性抗體相對含量的—個半定量指標,即在給定的條件下,結合—定量抗原的抗血清的稀釋度。抗血清經一系列稀釋后(如倍比稀釋)與定量的抗原反應,以能檢測抗血清最大稀釋倍數即為該抗血清的效價。不同的檢測方法測定同一種抗血清的效價,靈敏度不一樣,抗血清的效價也不一樣,如沉澱反應(瓊脂雙擴散)與ELISA二者的效價相差甚大,後者遠高於前者。放射免疫分析(RIA)常用於標記小分子抗原來檢測抗血清的效價。
親和力(affinity)表示抗血清與相應抗原的結合強度,是描述抗體持異性的重要指標,
常用親和常數K表示。親和常數K與抗原抗體反應的平衡常數有關:
抗體特異性與交叉反應:抗體是特異的。只與相應抗原反應。實際製備的抗體卻常有非特異性反應,這是因為抗原不純造成的。多組分抗原之間存在共同的抗原決定簇,或者兩個抗原決定簇結構類似能與同一抗體結合,均可出現抗體與異源抗原的交叉反應。用瓊脂雙擴散能簡便直觀地反映不同抗原與同一抗血清,或不同抗血清與同一抗原的交叉反應。
製備原理
單克隆抗體(MAb)與抗血清(又稱多克隆抗體,PAb)最主要的區別是MAb為單一種B細胞克隆所產生的一種均一的免疫球蛋白分子。所以MAb是B細胞克隆的標誌,是一種獨特型的抗體,它的特異性是針對一個抗原決定簇的。製備單克隆抗體不能用化學分離的方法從多克隆抗體中去分離純化得到它,而是用分離產生抗體的B細胞克隆的方法得到它。為了使B細胞克隆能在體外人工培養下長期存活併產生完全均一的MAb,G.KÖhler合Milstein於1975年創立了雜交瘤方法。所以製備單克隆抗體的技術又稱雜交瘤技術(hybredoma technique)。
雜交瘤技術的基本原理是用分泌抗體但不能長期培養的B細胞與能在體外長期培養並可低溫保存的腫瘤細胞進行雜交。篩選得到的雜交瘤細胞應該是既能分泌抗體又有瘤細胞的特性,可長期傳代培養,又可在液氮中保存的細胞。把這些細胞單克隆化,用單克隆化的雜交瘤細胞進行單克隆抗體的生產。
細胞雜交與選擇培養
(1)融合:細胞雜交之前,要分別準備好脾臟的B細胞懸液和小鼠骨髓瘤細胞(如SP2/0—Agl4細胞株)。免疫后的小鼠脾臟在無菌條件下破碎,將B細胞懸浮在沒有血清的培養液中(通常使用RPMIl640商品配製),並洗滌3次去掉小鼠的血清。SP2/0細胞是用加有10%胎牛或小牛血清培養的,每天更換新鮮培養液使成為對數分裂期生長旺盛的細胞。細胞用RPMIl640洗滌2—3次,把兩種細胞合併在同—試管中,用50%的聚乙二醇(相對分子質量為1000—1500)作為融合劑,在37℃條件下融合l—2min。然後用1640培養液緩慢稀釋,然後除去PEG,將細胞分散至HAT選擇培養板中。電融合方法也可用於單克隆抗體製備,雖融合率較高,但一次融合的細胞數少,且需專門設備,故限制了其廣泛使用。融合時脾細胞和骨髓瘤細胞的比例在5:1—10:1均可獲得滿意結果,每次融合細胞數量在10—10較為合適。融合后的細胞在40或96孔板上的HAT培養液(RPMIl640含10%—20%胎牛或小牛血清和HAT)中37℃,5%CO2條件下培養。融合后的細胞懸液中只有脾細胞和骨髓瘤細胞形成的雜交瘤細胞能在HAT培養基中生長,其他形式的融合細胞均不能生長.未融合的細胞也不能在HAT培養液中生存。
在融合后的細胞培養過程中,飼養細胞(feeder cell)有助於雜交瘤細胞的生長。飼養細胞可用同種動物的腹腔細胞或胸腹細胞。腹腔細胞中的吞噬細胞能清除死亡細胞碎片。使背景更為清潔「乾淨」。同時飼養細胞分泌的細胞因子或活性物質有助於雜交瘤細胞的生長。現有商品「雜交瘤細胞生長因子」可用於替代飼養細胞。
(2)陽性雜交瘤細胞的篩選與單克降化:雜交細胞經約10—14d培養后,形成可用的細胞集落(克隆)。經過幾次更換培養液(HT培養液)後進行抗體活性檢測。常用的篩選槍測方法是ELISA和凝集試驗,前者常用於可溶性抗原,後者適用於細胞、細菌等表面抗原。此外,Dot-ELISA、免疫印跡及免疫熒光試驗均可用於雜交瘤細胞的篩選。
使許多細胞克隆混合生長的細胞分離為單個的細胞克隆的過程稱克隆化(colonization)最常用的單克隆化方法是有限稀釋法(limited dilution),即將混合細胞經稀釋後分裝於培養板上,使培養板的大部分孔中只出現一個細胞。為了確保抗體分泌細胞來源於單個細胞,克隆化過程可重複進行,稱為亞克隆化(subclonization)。除有限稀釋法外,熒光激活細胞分揀法(FACS)也用於雜交瘤細胞的克隆化過程。
人單克隆抗體的製備
小鼠的單克隆抗體蛋白應用於人體后,作為抗原能引起人的免疫應答,大大降低其生物活性,並可能導致變態反應。因此人源單克隆抗體在臨床治療上有廣泛應用前景,引起人們的普遍興趣。但是人單克隆抗體製備存在許多技術上和倫理上的障礙,如人雜交瘤細胞系不穩定,有些抗原不能對人進行人工免疫,人B細胞只能從外周血中分離而無法從脾臟取得等。儘管如此,一些人源單克隆抗體已經獲得,技術上也在逐步完善起來。
人的瘤細胞株U—266常用來與人外周血B細胞融合以獲得人源單克隆抗體。另一些淋巴母細胞抹(LCL)則來源於EB病毒轉化的淋巴細胞,如GMl500,W1—L2和ARH77等也用於雜交瘤細胞的製備。這些細胞系表現ED病毒核抗原(EBNA)陽性,且形成的雜交瘤細胞抗體的分泌水平不高。
獲得人單克隆抗體的另一方法是用EBV直接轉化某些抗體分泌細胞,使之成為「不死」的細胞在體外培養。EBV感染人B細胞后,病毒基因插入人B細胞基因組中,有1%的細胞轉化為「不死」的細胞。B細胞轉化可通過「病毒驅動」和「細胞驅動」兩種方法獲得。前者是將B細胞與分泌EBV的B95—8細胞系一同培養,後者則是與EBNA陽性的LCL細胞一同培養。「細胞驅動」轉化的B細胞比較穩定,抗體分泌能力也較強。
人淋巴母細胞系和人雜交瘤細胞較難獲得,人單克隆抗體也可以通過異源雜文的辦法製備,即將EBV轉化的B細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合,將獲得的異源雜交瘤細胞再與免疫后的B細胞融合,得到人單克隆抗體分泌細胞,不產生自身免疫球蛋白,EBVA也是陰性。
抗體的化學修飾
抗體Fc段用雙功能連接劑與熒光素,同位素,酶,發光化合物,稀土元素以及藥物,毒素等連接后,並不影響其Fab功能區與特異性抗原結合。根據交聯物的性質不同,標記的抗體可用作診斷試劑,也可作為藥物的定向載體,引導藥物或毒素到達抗原存在部位使藥物或使毒素髮揮更有效的作用,即俗稱「生物導彈」。從而減少藥物、毒素、同位素、酶在腫瘤治療過程中引起嚴重的副作用,大大提高治療腫瘤的效果。
許多毒素如蓖麻毒素,白喉毒素,天花粉,紅豆毒素等均為蛋白質或糖蛋白,可用雙功能劑與抗體相連;嗎啡,前列腺素,氨甲喋吟,磷酸酯酶C等含有羧基能用碳二亞胺(EDC),混合酸酐法與抗體的氨基形成醯胺鍵;同樣,含脂肪胺的藥物如慶大雷素,阿黴素在水溶性EDC的作用下與抗體的羧基連接;而含芳香胺的藥物則先在低溫下與亞硝酸作用形成重氮化合物,再與抗體分子上的酪氨酸或組氨酸殘基形成偶氮鍵。總之通過抗體的化學修飾把抗體的特異性用到定向給葯和定位檢測上。
抗體基因的改造
將鼠源抗體的V區基因與人源抗體C區基因重組,獲得的嵌合抗體(chimericalantibody),可保留鼠抗體對抗原的高親和性,又減弱鼠源抗體對人的免疫原性,提高治療性抗體的效果。
重組的嵌合抗體基因轉化骨髓瘤細胞或中國地鼠卵細胞(CH0),可在其中表達。為了進一步地消除鼠抗體V區框架區(FW)的異源性,可實行CDR移植(CDR grafting),以獲得與鼠FW類似的人FW結構的嵌合抗體。
噬菌體表達的抗體僅含V區(scFv)或Fab片段,缺乏Fc區,使抗體的穩定性下降,半衰期縮短,與Fc受體結合功能也消失。因此在抗體功能片段的末端連接A蛋白、酶、細胞因子、CD4和毒素等分子,既可增加抗體片段的穩定性,又可發揮某些生物學活性功能。
用抗體基因工程方法獲得的抗體與效應分子交聯物比用化學交聯法具有優點:可以大量生產,不會因修飾作用影響抗體及效應分子的活性,效應分子還可根據需要進行改造。
此外在抗體片段的末端連接一段特異的雙親性螺旋(amphiphilic helixes)結構,如亮氨酸拉鏈結構(leucine zipper),可使單價的scFv或Fab片段在體內或體外形成穩定的雙分子聚合體,從而提高抗體片段的親和力。此法也可用於製備雙特異性抗體。
催化性抗體的製備抗體催化的化學反應
由抗體催化的化學反應特異性高於酶,但催化速率低於常規的酶,只有l0—10倍。但有一些未發現催化劑的反應,如Diels—Alder反應也能被抗體催化。常規酶一般不能催化胺鍵水解,抗體酶能使胺鍵水解的速度增加25萬倍。迄今為止,已發現和證明的由抗體催化的化學反應不下40種。

催化性抗體的製備

抗體酶是抗原決定簇處於轉換態結構的抗體。因為轉換態分子極不穩定無法製備抗體,所以催化性抗體的獲得主要是通過設計穩定的轉換態的類似物作為半抗原,與載體蛋白交聯后,免疫動物,獲得針對半抗原的抗體,從中篩選具有催化活性的抗體。篩選催化性單克隆抗體所用的ELISA與篩選一般抗體的方法不完全一樣,應根據催化反應的特點而進行適當的修改。經典的方法是先篩選出與底物或半抗原結合的抗體,然後從中再篩選出有催化活力的抗體,這種方法費時費力。利用催化性抗體對底物的催化活性,對底物進行適當修飾,使催化反應的產物可直接表現抗體的催化活性,這樣可以簡化檢測步驟。
轉換態類似物半抗原的設計,必須了解催化反應的轉換態模型的結構特點。催化抗體的抗原結合位點上與轉換態互補的某些催化基團的形成,能穩定轉換態分子。此外有人把單克隆抗體分子用化學修飾方法引入一些活性基團,提高催化性抗體的催化與親和效率。應用噬菌體抗體文庫也可以篩選催化性抗體,可省去製備轉換態類似物的複雜過程,直接用底物從文庫中篩選有催化活性的抗體片段。如用半抗原免疫后製備的文庫或文庫經過多次混雜重組,則可以得到更高的親和力的催化性抗體。抗獨特型抗體也用於催化性抗體的製備,用酶作為抗原免疫小鼠獲得能夠封閉酶活性位點的單克隆抗體,將這個抗體用蛋白酶除去Fc片段,用Fab免疫其他品系的小鼠或家兔,得到的抗體具有相應的酶催化活性。
從理論上看,B細胞具有全套免疫球蛋白的多樣性的胚系基因,當然也包括有催化作用的自身抗體在內。然而1989年Paul W.首次報道了人體的一種能催化蛋白質水解的免疫球蛋白。它是—種自身抗體,能水解血管活性腸肽(vasoactive intenstinal peptide,VIP)的Glnl6—Met17鍵。用VIP作為抗原能得到有催化作用的單克隆抗體,也能催化Glnl6—Met17鍵。大約有17%的人有這種自身抗體酶,但患有氣喘的病人中該抗體與VIP的親和力比健康人高50倍。由於VIP是一種氣管鬆弛劑,因此有人認為這種VIP自身抗體的長期作用可能與氣喘的過敏應答有一定關係。由此推測除了人工設計催化抗體以及發現的自身催化抗體外,用篩選單抗的方法,也有可能找到所需要的催化抗體。

4抗原抗體反應原理

[1-4]抗體能特異性地識別相應的抗原,並與之結合。這種結合在體外也能發生,這種
抗原抗體反應模式圖

  抗原抗體反應模式圖

特性就是許多免疫檢測方法的基礎。抗原與抗體相互作用是非共價的,可逆的,其特性符合許多化學反應的基本原理。但因為抗體分子的結構特點,以及抗原分子結構的多樣性,使抗原抗體結合反應表現出複雜性。
上一篇[大有徑庭]    下一篇 [不勝其任]

相關評論

同義詞:暫無同義詞