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抗氧化功能評價方法

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為貫徹落實《食品安全法》及其實施條例對保健食品實行嚴格監管的要求,加強保健食品准入管理,切實提高准入門檻,2012年4月23日,國家食品藥品監督管理局以國食葯監保化〔2012〕107號印發《抗氧化功能評價方法》。該《評價方法》分試驗項目、試驗原則及結果判定,抗氧化功能檢驗方法2部分。自2012年5月1日起,對受理的申報註冊保健食品的相關產品檢驗申請,保健食品註冊檢驗機構應按新功能評價方法開展產品功能評價試驗等各項工作。

1 抗氧化功能評價方法 -國家食品藥品監督管理局通知

  國家食品藥品監督管理局關於印發抗氧化功能評價方法等9個保健功能評價方法的通知

  國食葯監保化〔2012〕107號

  各省、自治區、直轄市食品藥品監督管理局(藥品監督管理局),有關單位:

  為貫徹落實《食品安全法》及其實施條例對保健食品實行嚴格監管的要求,加強保健食品准入管理,切實提高准入門檻,國家食品藥品監督管理局組織修訂了抗氧化等9個功能的評價方法,已經保健食品安全專家委員會審議通過,現予印發。自2012年5月1日起,對受理的申報註冊保健食品的相關產品檢驗申請,保健食品註冊檢驗機構應當按照新發布的9個功能評價方法開展產品功能評價試驗等各項工作。

  附件:1.抗氧化功能評價方法

  2.對胃粘膜損傷有輔助保護功能評價方法(略)

  3.輔助降血糖功能評價方法(略)

  4.緩解視疲勞功能評價方法(略)

  5.改善缺鐵性貧血功能評價方法(略)

  6.輔助降血脂功能評價方法(略)

  7.促進排鉛功能評價方法(略)

  8.減肥功能評價方法(略)

  9.清咽功能評價方法(略)

  國家食品藥品監督管理局

  二○一二年四月二十三日

2 抗氧化功能評價方法 -抗氧化功能評價方法

試驗項目、試驗原則及結果判定

  Items, Principles and Result Assessment

  1 試驗項目

  1.1 動物實驗

  1.1.1 體重

  1.1.2 脂質氧化產物:丙二醛或血清8-表氫氧異前列腺素(8-Isoprostane)

  1.1.3 蛋白質氧化產物:蛋白質羰基

  1.1.4 抗氧化酶:超氧化物歧化酶或谷胱甘肽過氧化物酶

  1.1.5 抗氧化物質:還原性谷胱甘肽

  1.2 人體試食試驗

  1.2.1 脂質氧化產物:丙二醛或血清8-表氫氧異前列腺素(8-Isoprostane)

  1.2.2 超氧化物歧化酶

  1.2.3 谷胱甘肽過氧化物酶

  2 試驗原則

  2.1 動物實驗和人體試食試驗所列的指標均為必測項目。

  2.2 脂質氧化產物指標中丙二醛和血清8-表氫氧異前列腺素任選其一進行指標測定,動物實驗抗氧化酶指標中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶任選其一進行指標測定。

  2.3 氧化損傷模型動物和老齡動物任選其一進行生化指標測定。

  2.4 在進行人體試食試驗時,應對受試樣品的食用安全性作進一步的觀察。

  3 結果判定

  3.1 動物實驗:脂質氧化產物、蛋白質氧化產物、抗氧化酶、抗氧化物質四項指標中三項陽性,可判定該受試樣品抗氧化功能動物實驗結果陽性。

  3.2 人體試食試驗:脂質氧化產物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶三項指標中二項陽性,且對機體健康無影響,可判定該受試樣品具有抗氧化功能的作用。

抗氧化功能檢驗方法

  Method for the Assessment of Antioxidative Function

  1 動物實驗

  1.1 實驗動物

  選用10月齡以上老齡大鼠或8月齡以上老齡小鼠,也可用氧化損傷模型鼠。單一性別,小鼠每組10-15隻,大鼠8-12隻。

  1.2 劑量分組及受試樣品給予時間

  實驗設三個劑量組和一個溶劑對照組,以人體推薦量的10倍(小鼠)或5倍(大鼠)為其中的一個劑量組,另設兩個劑量組,高劑量一般不超過30倍,必要時設陽性對照組、空白對照組。受試樣品給予時間30天,必要時可延長至45天。

  1.3 實驗方法

  1.3.1 老齡動物

  選用10月齡以上大鼠或8月齡以上小鼠,按血中MDA水平分組,隨機分為1個溶劑對照組和3個受試樣品劑量組。3個劑量組給予不同濃度受試樣品,對照組給予同體積溶劑,實驗結束時處死動物測脂質氧化產物含量、蛋白質羰基含量、還原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

  1.3.2 D-半乳糖氧化損傷模型

  1.3.2.1原理

  D-半乳糖供給過量,超常產生活性氧,打破了受控於遺傳模式的活性氧產生與消除的平衡狀態,引起過氧化效應。

  1.3.2.2造模方法

  選25-30g健康成年小鼠,除空白對照組外,其餘動物用D-半乳糖40mg-1.2g/kg BW頸背部皮下注射或腹腔注射造模,注射量為0.1mL/10g,每日1次,連續造模6周,取血測MDA,按MDA水平分組。隨機分為1個模型對照組和3個受試樣品劑量組,3個劑量組經口給予不同濃度受試樣品,模型對照組給予同體積溶劑,在給受試樣品的同時,模型對照組和各劑量組繼續給予相同劑量D-半乳糖頸背部皮下或腹腔注射,實驗結束處死動物測脂質氧化產物含量、蛋白質羰基含量、還原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

  1.3.3 乙醇氧化損傷模型

  1.3.3.1原理

  乙醇大量攝入,激活氧分子產生自由基,導致組織細胞過氧化效應及體內還原性谷胱甘肽的耗竭。

  1.3.3.2造模方法

  選25-30g健康成年小鼠(180-220g大鼠),隨機分為4個組,1個模型對照組和3個受試樣品劑量組,必要時可增設1個空白對照組。3個劑量組給予不同濃度受試樣品,模型對照組給予同體積溶劑,連續灌胃30天,末次灌胃后,模型組對照組和3個劑量組禁食16小時(過夜),然後1次性灌胃給予50%乙醇12ml/kgBW,6小時后取材(空白對照組不作處理,不禁食取材),測血清或肝組織脂質氧化產物含量、蛋白質羰基含量、還原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

  1.3.4脂質氧化產物測定

  1.3.4.1 血中過氧化脂質降解產物丙二醛(MDA)含量測定

  血中過氧化脂質降解產物丙二醛(MDA)含量可採用熒光法和比色法測定,方法任選其一。

  1.3.4.1.1 熒光法

  1.3.4.1.1.1 熒光法原理

  MDA(malondiadehycle)是細胞膜脂質過氧化的終產物之一,測其含量可間接估計脂質過氧化的程度。1個丙二醛(MDA)分子與2個硫代巴比妥酸(TBA)分子在酸性條件下共熱,形成粉紅色複合物。以波長536nm為激發光,在550nm有最強熒光強度。可用熒光法進行微量測定。

  1.3.4.1.1.2 儀器與試劑

  儀器:熒光分光光度計、微量加樣器、恆溫水浴鍋、普通離心機、混旋器、具塞離心管

  試劑:

  10mmol/L四乙氧基丙烷(貯備液,棕色瓶4℃保存12個月),臨用前用純水稀釋成1nmol/mL

  29mmol/L硫代巴比妥酸工作液

  硫代巴比妥酸 0.209g

  EDTA.2H20 25mg

  谷胱甘肽(還原型) 1mg

  用0.02mol/L NaOH 50 mL 溶解(微溫助溶,棕色瓶4℃保存2周)

  酸水解液

  0.1mol/L H2SO4 125mL

  0.1mol/L Na2SO4 125mL

  加水150mL用 H2SO4 調pH 1.5,加水稀釋至500mL

  正丁醇

  以上所用玻璃器皿均需經50%硝酸浸泡24h后,再經蒸餾水、雙蒸水淋洗乾燥,試劑(選AR級)最好用雙蒸水配製。

  1.3.4.1.1.3 實驗步驟

  1.3.4.1.1.3.1 樣品製備

  全血上清液:取血50μl加入0.5mL生理鹽水,2000r/min離心10min,取上清液待測。

  血清樣品:取血0.5mL室溫靜置10min,2000r/min離心10min,取上清液待測。

  1.3.4.1.1.3.2 標準曲線製作

  將10nmol/mL四乙氧基丙烷,用雙蒸水稀釋成0.0、0.25、0.5、1.0、1.5、2、3、5、10nmol/mL分別取0.1mL加入酸水解液 2mL、TBA工作液0.5mL→混勻,避光、沸水浴60min→流水冷卻至室溫→3mL正丁醇振蕩抽提1min→3000r/min離心5min→取上清液(正丁醇層)測熒光強度(入射狹縫1.5nm,出射狹縫5nm, 激發波長536nm,發射波長550nm)

  以四乙氧基丙烷濃度為橫坐標,熒光強度為縱坐標作圖。

  1.3.4.1.1.3.3樣品測定

  

試劑空白管樣本管標準管
10mL具塞離心管0.1mL蒸餾水0.1mL血清*0.1mL標準#
酸水解液2mL2mL2mL
TBA工作液0.5mL0.5mL0.5mL
混勻,避光沸水浴60min,流水冷卻
正丁醇3mL3mL3mL
振蕩抽提1min,3000r/min 離心5min
 *全血上清液 0.5mL(空白管加蒸餾水0.5mL,標準管加標準0.1mL、蒸餾水0.4mL)

  #1nmol/mL四乙氧基丙烷(標準)

  血清0.1mL(或全血上清液0.5mL)→加入酸水解液 2mL、TBA工作液0.5mL→混勻,避光、沸水浴60min→流水冷卻至室溫→3mL正丁醇振蕩抽提1min→3000r/min離心5min→取上清液(正丁醇層)測熒光強度(入射狹縫1.5nm,出射狹縫5nm, 激發波長536nm,發射波長550nm)

  1.3.4.1.1.3.4 計算公式:

  B-A B-A

  過氧化脂質含量(nmol/mL血清)=———×C×K =————×1×1

  F-A F-A

  B-A B-A 1

  過氧化脂質含量(nmol/mL血液)=———×C×K =———×1×————

  F-A F-A 0.05

  A:空白管熒光度

  B:樣品熒光度

  F:四乙氧基丙烷熒光度

  C:四乙氧基丙烷濃度(1nmol/mL)

  K:稀釋倍數

  1.3.4.1.2比色法

  1.3.4.1.2.1比色法原理

  MDA(malondiadehycle)是細胞膜脂質過氧化的終產物之一,測其含量可間接估計脂質過氧化的程度。1個丙二醛(MDA)分子與2個硫代巴比妥酸(TBA)分子在酸性條件下共熱,形成粉紅色複合物。該物質在波長532nm有極大吸收峰。可用分光光法進行測定。

  1.3.4.1.2.2 儀器與試劑

  儀器:可見光分光光度計、酶標儀、微量加樣器、恆溫水浴鍋、普通離心機、混旋器、具塞離心管。

  試劑:0.2M乙酸鹽緩衝液 pH3.5

  0.2M乙酸溶液 185mL

  0.2M乙酸鈉溶液 15mL

  1mmol/L四乙氧基丙烷(貯備液,4℃保存3個月),臨用前用水稀釋成40nmol/mL

  8.1%十二烷基硫酸鈉SDS

  0.8%硫代巴比妥酸TBA

  0.2M磷酸鹽緩衝液 pH7.4

  0.2M磷酸氫二鈉 1920mL

  0.2M 磷酸二氫鉀 480mL

  1.3.4.1.2.3 實驗步驟

  1.3.4.1.2.3.1 樣品製備

  溶血液樣品:取血20μL加入0.98mL蒸餾水製成2%溶血液。

  1.3.4.1.2.3.2樣品測定

  
試劑空白管樣品管標準管
2%溶血液*​0.2mL​
40nmol/mL四乙氧基丙烷​​0.2mL
8.1%SDS0.2mL0.2mL0.2mL
0.2M乙酸鹽緩衝液1.5mL1.5mL1.5mL
0.8%TBA1.5mL1.5mL1.5mL
H2O0.8mL0.6mL0.6mL
混勻,避光沸水浴60min,流水冷卻,於532nm比色
 註:如用試劑盒,可按試劑盒的操作要求進行。

  *若用血清,樣品管0.15mL,標準管0.15mL。

  1.3.4.1.2.3.3計算

  B – A B – A

  過氧化脂質含量(nmol/mL2%溶血液)=————×C×K = —————×40×1

  F – A F – A

  B – A B – A

  過氧化脂質含量(nmol/mL血清)=————×C×K = —————×40×1

  F – A F – A

  A: 空白管吸光度

  B:樣品吸光度

  F:四乙氧基丙烷吸光度

  C:四乙氧基丙烷濃度(40nmol/mL)

  K:稀釋倍數

  1.3.4.2組織中過氧化脂質降解產物丙二醛(MDA)含量測定

  1.3.4.2.1 原理

  見1.3.4.1.2.1

  1.3.4.2.2 儀器與試劑

  儀器:可見光分光光度計、酶標儀、微量加樣器、恆溫水浴鍋、普通離心機、混旋器、具塞離心管、組織勻漿器

  試劑:見1.3.4.1.2.2

  1.3.4.2.3 實驗步驟

  1.3.4.2.3.1 樣品製備

  組織勻漿樣品:取一定量的所需臟器,生理鹽水沖洗、拭乾、稱重、剪碎,置勻漿器中,加入0.2M磷酸鹽緩衝液,以20000r/min勻漿10s,間歇30s,反覆進行3次,製成10%組織勻漿(W/V),3000r/min離心5-10min,取上清液待測。

  1.3.4.2.3.2樣品測定

  
試劑空白管樣品管標準管
10%組織勻漿​0.2mL​
40nmol/mL四乙氧基丙烷​​0.2mL
8.1%SDS0.2mL0.2mL0.2mL
0.2M乙酸鹽緩衝液1.5mL1.5mL1.5mL
0.8%TBA1.5mL1.5mL1.5mL
H2O0.8mL0.7mL0.7mL
混勻,避光沸水浴60min,流水冷卻,於532nm比色
 註:如用試劑盒,可按試劑盒的操作要求進行

  1.3.4.2.3.3計算

  B - A B- A 1

  過氧化脂質含量 = ————×C×K = ———×40×————————

  (nmol/mg組織) F - A F - A 0.2×10%×1000

  A: 空白管吸光度

  B:樣品管吸光度

  F:四乙氧基丙烷吸光度

  C:四乙氧基丙烷濃度(40nmol/mL)

  K:稀釋倍數

  1.3.4.3 血清中8-表氫氧-異前列腺素(8-Isoprostane)測定

  1.3.4.3.1原理

  8-表氫氧-異前列腺素(8-Isoprostane)是體內脂質氧化應激反應穩定而具有特異性的標誌物,其含量能間接反應因機體內自由基的產生而導致組織細胞的脂質過氧化程度。

  1.3.4.3.2儀器與試劑

  儀器:酶標儀、生化培養箱、微量振蕩器、微量加樣器、洗板機

  試劑:8-Isoprostane KIA Kit (酶聯免疫試劑盒)

  8-Isoprostane EIA 抗體血清、8-Isoprostane AChE示蹤物、8-Isoprostane EIA標準品、EIA緩衝液、洗滌緩衝液、吐溫20、鼠抗-兔IgG抗體、EIA示蹤染色劑、EIA抗體血清染色劑、Ellman』s試劑

  1.3.4.3.3實驗步驟

  1.3.4.3.3.1樣品製備

  小鼠眼內眥靜脈叢取血,3000r/min離心10min。取上清液,用EIA 緩衝液稀釋15倍備用。

  1.3.4.3.3.2樣品測定

  按試劑盒說明操作。

  8-表氫氧異前列腺素標準孔濃度分別為:500 pg/mL、200 pg/mL、80 pg/mL、32 pg/mL、12.8 pg/mL、5.1 pg/mL、2.0 pg/mL、0.8pg/mL

  
步驟試劑空白TANSBB0標準/樣品
1.加試劑EIA 緩衝液--100μL50μL-
標準/樣品----50μL
AChE示蹤物--50μL50μL50μL
抗體血清---50μL50μL
2.培養用封板膜蓋好酶標板,並在4℃避光條件下培養18小時
3.清洗清洗所有反應孔五次
4.加試劑AChE示蹤物-5μL---
Ellman』s200μL200μL200μL200μL200μL
5.培養用封板膜蓋好酶標板,並在常溫避光條件下培養45-90分鐘
6.讀數在波長412nm處測量各孔吸光度(B0在 0.3-1.0 A.U範圍)
 標準或樣品孔吸光度 — NSB孔吸光度

  %B/B0= ——————————————————×100

  B0孔吸光度 — NSB孔吸光度

  以標準物的濃度的對數(log)為橫坐標,%B/B0為縱坐標繪製標準曲線,亦可將數據轉換成logit(B/B0)或ln[B/B0/(1-B/B0)]做為縱坐標繪製標準曲線,計算回歸方程。將樣品的%B/B0值,代入方程式,計算出樣品的濃度,再乘以稀釋倍數,即為樣品中的8-表氫氧異前列腺素濃度。

  1.3.5蛋白質氧化產物測定

  H2O2或O2·ˉ自由基對蛋白質氨基酸側鏈的氧化可導致羰基產物的積累。羥自由基也可直接作用於肽鏈,使肽鏈斷裂,引起蛋白質一級結構的破壞,在斷裂處產生羰基。羰基化蛋白極易相互交聯、聚集為大分子從而降低或失去原有蛋白質的功能,蛋白質羰基含量可直接反映蛋白質損傷的程度。蛋白質羰基形成是多種氨基酸在蛋白質的氧化修飾過程中的早期標誌,它隨著年齡的增長而增加。

  1.3.5.1血清中蛋白質羰基測定

  1.3.5.1.1原理

  被氧化后的蛋白質羰基含量增多,羰基可與2,4-二硝基苯肼反應生成2,4-二硝基苯腙,2,4.二硝基苯腙為紅棕色的沉澱,將沉澱用鹽酸胍溶解后即可在分光光度計上讀取370 nm下的吸光度值,從而測定蛋白質的羰基含量。

  1.3.5.1.2儀器與試劑

  儀器:紫外分光光度計、酶標儀、微量加樣器、生化培養箱、恆溫水浴鍋、低溫高速離心機、混旋器、2ml離心管。

  試劑:10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼(DNPH)

  99毫克2,4-二硝基苯肼用50ml 2 mol/L HCL 溶解,4℃避光保存。

  2 mol/L HCL

  200 g/L 三氯乙酸(TCA)

  6 mol/L 鹽酸胍

  無水乙醇乙酸乙酯混合應用液

  將無水乙醇和乙酸乙酯按照體積比1:1的比例配置成混合溶液,現用現配。

  1.3.5.1.3操作步驟

  
試劑測定管對照管
血清(血漿)0.1ml0.1ml
10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼0.4ml​
2 mol/L HCL​0.4ml
渦旋混勻1分鐘,37℃準確避光反應30分鐘
200 g/L 三氯乙酸0.5ml0.5ml
渦旋混勻1分鐘,以4℃下,以12000r/min離心10min,棄上清,留沉澱
無水乙醇乙酸乙酯混合應用液1.0ml1.0ml
渦旋混勻1分鐘,以4℃下,以12000r/min離心10min,棄上清,留沉澱
無水乙醇乙酸乙酯混合應用液1.0ml1.0ml
渦旋混勻1分鐘,以4℃下,以12000r/min離心10min,棄上清,留沉澱
無水乙醇乙酸乙酯混合應用液1.0ml1.0ml
渦旋混勻1分鐘,以4℃下,以12000r/min離心10min,棄上清,留沉澱
無水乙醇乙酸乙酯混合應用液1.0ml1.0ml
渦旋混勻1分鐘,以4℃下,以12000r/min離心10min,棄上清,留沉澱
6 mol/L 鹽酸胍1.25ml1.25ml
混勻后,37℃準確水浴15分鐘
 渦旋混勻,將全部沉澱溶解,以12000r/min離心15min,取上清液在370nm處比色,6 mol/L 鹽酸胍試劑調零,測定OD值。用雙縮脲法測定血清(或血漿)蛋白質含量。

  註:如用試劑盒,可按試劑盒的操作要求進行。

  1.3.5.1.4計算公式

  測定管OD-對照管OD

  蛋白質羰基含量 = ——————————————————————×125×105

  (nmol/mgprot) 22×比色光徑(cm)×樣本蛋白濃度(mg/L)

  1.3.5.2組織中蛋白質羰基測定

  1.3.5.2.1原理

  見1.3.5.1.1

  1.3.5.2.2 儀器與試劑

  儀器:紫外分光光度計、酶標儀、微量加樣器、生化培養箱、恆溫水浴鍋、天平、勻漿器、低溫高速離心機、混旋器、2ml離心管。

  試劑:

  10 mmol/L hepes緩衝液 pH7.4

  2.38克N-2-羥乙基哌嗪-2』-乙磺酸(HEPES)溶入1000ml雙蒸餾水,用lN NaOH 調pH至7.4,4℃保存。

  100 g/L 硫酸鏈黴素

  1g硫酸鏈黴素,溶入10ml雙蒸餾水,4℃避光保存。

  10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼(DNPH)

  99毫克2,4-二硝基苯肼用50ml 2 mol/L HCL 溶解,4℃避光保存。

  2 mol/L HCL

  200 g/L 三氯乙酸(TCA)

  6 mol/L 鹽酸胍

  無水乙醇乙酸乙酯混合應用液

  將無水乙醇和乙酸乙酯按照體積比1:1的比例配置成混合溶液,現用現配。

  1.3.5.2.3 實驗步驟

  1.3.5.2.3.1樣品處理

  取0.1g組織,在冰的生理鹽水中漂洗,以去掉表面的血跡。加人0.9ml的冰的10 mmol/L HEPES緩衝液(pH7.4),製成10% 的勻漿。將勻漿液以3000r/min的轉速,離心10 min,保留上清。取100g/L的硫酸鏈黴素溶液50µl,加入上清液450µl(v/v,1:9),室溫放置10 min后,以11000r/min的轉速,離心10 min,取上清液待測。

  1.3.5.2.3.2操作步驟

  
試劑測定管對照管
組織勻漿上清液0.1ml0.1ml
10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼0.4ml​
2 mol/L HCL​0.4ml
渦旋混勻1分鐘,37℃準確避光反應30分鐘
200 g/L 三氯乙酸0.5ml0.5ml
渦旋混勻1分鐘,以4℃下,以12000r/min離心10min,棄上清,留沉澱
無水乙醇乙酸乙酯混合應用液1.0ml1.0ml
渦旋混勻1分鐘,以4℃下,以12000r/min離心10min,棄上清,留沉澱
無水乙醇乙酸乙酯混合應用液1.0ml1.0ml
渦旋混勻1分鐘,以4℃下,以12000r/min離心10min,棄上清,留沉澱
無水乙醇乙酸乙酯混合應用液1.0ml1.0ml
渦旋混勻1分鐘,以4℃下,以12000r/min離心10min,棄上清,留沉澱
無水乙醇乙酸乙酯混合應用液1.0ml1.0ml
渦旋混勻1分鐘,以4℃下,以12000r/min離心10min,棄上清,留沉澱
6 mol/L 鹽酸胍1.25ml1.25ml
混勻后,37℃準確水浴15分鐘
 渦旋混勻,將全部沉澱溶解,以12000r/min離心15min,取上清液在370nm處比色,6 mol/L 鹽酸胍試劑調零,測定OD值。用雙縮脲法測定勻漿上清液蛋白質含量。

  註:如用試劑盒,可按試劑盒的操作要求進行。

  1.3.5.2.3.3計算公式

  測定管OD-對照管OD

  蛋白質羰基含量 = ——————————————————————×125×105

  (nmol/mgprot) 22×比色光徑(cm)×樣本蛋白濃度(mg/L)

  1.3.5.3 注意事項

  1.3.5.3.1 加入硫酸鏈黴素:在勻漿上清液中加人硫酸鏈黴素溶液的作用是沉澱核酸。核酸中的一些鹼基如鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶等也含有羰基,如不去除核酸,這些鹼基就會與DNPH結合,並反應生成有色物質,這些物質會增加最後溶液的吸光度,使結果偏大 。

  1.3.5.3.2 DHPH的溶解:DNPH不溶於水,只能溶於稀酸和稀鹼等溶液,因此,用2 mol/L HC1來溶解DNPH。設對照管是為了避免HC1與反應液中一些物質反應生成對比色有影響的物質。

  1.3.5.3.3 反應體系應避光:當蛋白質溶液中加人DNPH進行反應時,反應體系需置於黑暗中,因為DNPH不穩定,見光會分解。如果反應體系遇到光,DNPH分解,體系中會有剩餘的沒有變成蛋白質腙衍生物,對反應比色有影響。

  1.3.5.3.4 去除未與蛋白質結合的DNPH:由於DNPH在370nm左右有強烈的光吸收,因而用乙醇和乙酸乙脂混合物反覆洗滌沉澱,去掉未與蛋白質結合的DNPH,否則,會增加吸光值。

  1.3.6 抗氧化酶活力測定

  SOD催化超氧陰離子自由基(O2·ˉ)生成H2O2,再由其它抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和過氧化氫酶作用生成水,這樣可以清除O2·ˉ對細胞的毒害作用。SOD、GSH-Px在動物某些器官和人體血紅細胞中的含量均有明顯的增齡變化,酶活性與生物年齡的增長成反比。消除自由基的能力與酶活性成正比。

  1.3.6.1 血或組織中超氧化物歧化酶(SOD)活力測定

  1.3.6.1.1 原理

  O2·ˉ氧化羥胺的最終產物為亞硝酸鹽,後者在對氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈現紫紅色,在波長530nm處有極大吸收峰,可用分光光度法進行測定,當SOD消除O2·ˉ后形成的亞硝酸鹽減少。

  1.3.6.1.2儀器與試劑

  儀器 可見光分光光度計、酶標儀、離心機、恆溫水浴、勻漿器

  試劑 65mM磷酸鹽緩衝液(PBS) pH7.8

  10mmol/L鹽酸羥胺

  鹽酸羥胺6.95mg,加PBS至10mL

  7.5mmol/L黃嘌呤

  黃嘌呤11.41mg,加0.1M NaOH 2.5mL溶解,加PBS至10mL

  0.2g/L黃嘌呤氧化酶

  取10g/L黃嘌呤氧化酶0.2mL加冰冷PBS 9.8mL至10mL

  0.1%甲萘胺

  取0.2gα-甲萘胺溶於40mL沸蒸餾水,涼至室溫加50mL冰醋酸,再加110mL涼蒸餾水至200mL

  0.33%對氨基苯磺酸

  取0.66g對氨基苯磺酸溶於150mL溫蒸餾水,加50mL冰醋酸至200mL

  SOD標準品

  三氯甲烷

  95%乙醇(v/v)

  0.9%生理鹽水

  1.3.6.1.3 實驗步驟

  紅細胞抽提液製備:10μl全血沖入0.5mL生理鹽水,2000r/min離心3min,棄上清,加冰冷的雙蒸水0.2mL混勻,加入95%乙醇0.1mL,振蕩30s,加入三氯甲烷0.1mL,置快速混合器抽提1min,4000r/min離心3min,分層,上層為SOD抽提液,中層為血紅蛋白沉澱物,下層為三氯甲烷,記錄上清液體積待測。

  組織勻漿的製備:剪取一定量的所需臟器,生理鹽水沖洗、拭乾、稱重、剪碎,至玻璃勻漿器中加入冷生理鹽水20000r/min勻漿10s,間歇30s,反覆進行三次,製成1%組織勻漿,(最好用超聲波發生器處理30s),使線粒體振破,以中性紅-詹鈉氏綠B染色證明線粒體已振碎。以4000r/min離心5min,取上清液20μl待測。

  SOD標準抑制曲線 將SOD標準品用磷酸鹽緩衝液配製成750U/mL的溶液,再稀釋到50倍,即SOD量為15U/mL(1.5μg/mL),用本法測定不同量的SOD標準液的百分抑制率,以百分抑制率為縱坐標,以SOD活力單位U/mL為橫坐標繪製標準曲線。

  對照管OD-測定管OD

  SOD百分抑制率=──────────────×100%

  對照管OD

  計算每mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為一個單位。

  (對照管OD-測定管OD)×100%

  對照管OD 反應液總量(6mL)

  SOD活力(U/mL)=───────── ×──────────×樣品稀釋倍數

  50% 取液量

  也可用酶比活法即以每管樣品的百分抑制率從SOD標準曲線查出相應的SOD U/mL,乘以稀釋倍數(1mL/取樣量)。

  若樣品為組織勻漿液,根據勻漿濃度或組織蛋白質含量,將單位換算為U/g組織或U/mg蛋白。若樣品為紅細胞抽提液,根據血紅蛋白含量,可換算為U/g Hb。

  樣品測定步驟:

  
試劑測定管對照管
1/15mol/L磷酸鹽緩衝液 pH7.8(mL)1.01.0
樣品A*​
10mmol/L鹽酸羥胺(mL)0.10.1
7.5mmol/L黃嘌呤(mL)0.20.2
0.2mg/mL黃嘌呤氧化酶(mL)0.20.2
雙蒸水(mL)0.490.49
 混勻,37℃恆溫水浴30min

  
0.33%對氨基苯磺酸(mL)2.02.0
0.1%甲萘胺(mL)2.02.0
 混勻15min后,倒入1cm光徑比色杯,以蒸餾水調零,530nm處比色測定OD值。

  * A 所用樣品的量

  
紅細胞抽提液10 μl
血清(或血漿)20-30 μl(溶血樣品剔除)
1%組織勻漿10-40 μl
 註:如用試劑盒,可按試劑盒的操作要求進行。

  1.3.6.2 血或組織中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力測定

  1.3.6.2.1 原理

  谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是體內存在的一種含硒清除自由基和抑制自由基反應的系統。對防止體內自由基引起膜脂質過氧化特別重要,其活力以催化GSH氧化的反應速度,及單位時間內GSH減少的量來表示,GSH和5,5』-二硫對硝基苯甲酸(DTNB)反應在GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基苯甲酸陰離子,於423nm波長有最大吸收峰,測定該離子濃度,即可計算出GSH減少的量,由於GSH能進行非酶反應氧化,所以最後計算酶活力時,必須扣除非酶反應所引起的GSH減少。

  1.3.6.2.2 試劑和儀器

  儀器:可見光分光光度計、酶標儀、低溫高速離心機、勻漿器、恆溫水浴鍋、微量加樣器

  試劑:疊氮鈉磷酸緩衝液 pH7.0

  
NaN316.25mg終濃度2.5mmol/L
EDTA-Na27.44mg終濃度0.2mmol/L
Na2HPO41.732g終濃度0.2mol/L
NaH2PO41.076g終濃度0.2mol/L
 加蒸餾水至100mL,用少量HCL、NaOH調pH7.0,4℃保存。

  1mmol/L谷胱甘肽(還原型GSH)溶液

  GSH 30.7mg加疊氮鈉磷酸緩衝液至100mL,臨用前配製,冰凍保存1-2日。

  1.25-1.5mmol/LH2O2溶液

  取30%H2O2 0.15-0.17mL,用雙蒸水稀釋至100mL,作為貯備液,4℃避光保存,臨用前將貯備液用雙蒸水稀釋10倍即可。

  偏磷酸沉澱液

  
HPO316.7g(先用蒸餾水溶解)
EDTA0.5g
NaCl280g
 加蒸餾水至1000mL,用普通濾紙過濾,室溫保存。

  0.32mol/LNa2HPO4溶液:

  Na2HPO4 22.7g加蒸餾水至500mL,室溫保存。

  DTNB顯色液

  
DTNB40mg
檸檬酸三鈉1.0g
 加蒸餾水至100mL,4℃避光保存1個月。

  0.2M磷酸緩衝液pH7.4

  0.9%生理鹽水

  1.3.6.2.3 實驗步驟

  1.3.6.2.3.1 樣品製備

  溶血液:取鼠血10μl加入到1mL雙蒸水中,充分振搖,使之全部溶血1:100待測,4h內測定酶活力。若當天來不及測定,將肝素抗凝全血置-20℃凍存,3d內測定,若4℃存放,28h內必須測完。測前取出樣品室溫自然解凍。

  組織上清液:動物禁食過夜,處死後,立即取出所需臟器,放入冷生理鹽水中洗去浮血,剔除脂肪及結締組織,濾紙吸干后,在冰浴上剪成碎塊,稱取適量組織,加冷0.2M磷酸緩衝液,以20000r/min勻漿10s,間歇30s,反覆3次製成5%組織勻漿,操作在冰浴中進行,勻漿以12500×g離心10min(低溫高速離心機),以沉澱為破碎的細胞、細胞碎片、核及線粒體,上清液用以測胞液中的酶活力,最好當天測,否則加20%(v/v)甘油分裝於塑料管,放置-20--80℃,可保存數周,而酶活力不減。

  1.3.6.2.3.2 GSH標準曲線的製作:

  取1.0mmol/LGSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,分別置於10mL小容器瓶中,各加入偏磷酸沉澱劑8mL,用雙蒸水稀釋至10mL刻度,即得到濃度為0、20、40、60、80、100μmol/L的 GSH標準液。

  取上述不同濃度標準液各2mL,放入試管中,加入0.32mol/L Na2HPO4 2.5mL,比色前加入DTNB顯色液0.5mL用光徑1cm杯,5min內在可見光423nm波長測OD值,以雙蒸水調零點。

  以GSH含量(μmol/L)為橫坐標,OD423值為縱坐標,繪製標準曲線。

  1.3.6.2.3.3 測定步驟:

  
試劑樣品管(mL)非酶管(mL)空白管(mL)
1.0mmol/LGSH0.40.4​
樣品**0.4​​
雙蒸水*​0.4​
37℃水浴預溫5min
H2O2(37℃預熱)0.20.2​
37℃水浴準確反應3min (嚴格控制時間)
偏磷酸沉澱液44​
3000r/min離心10min
離心上清液22​
雙蒸水​​0.4
偏磷酸沉澱液​​1.6
0.32mol/LNa2HPO42.52.52.5
DTNB顯色液0.50.50.5
 顯色反應1min後於423nm波長(1cm光徑),讀OD值,5min之內讀數準確。

  * 樣品為組織上清液時,非酶管改為加熱使酶失活的組織上清液。

  **溶血液 0.1-0.4mL

  組織上清液 1:20稀釋,取稀釋液0.4mL

  註:如用試劑盒,可按試劑盒的操作要求進行。

  1.3.6.2.3.4 計算

  鼠全血GSH-Px活力單位 規定每1mL全血,每分鐘,扣除非酶反應的log[GSH]降低后,使log[GSH]降低1為一個酶活力單位。

  非酶管log[GSH]-樣品管log[GSH]

  鼠全血GSH-Px活力單位(U/mL全血)= ────────────────

  3min×0.004mL

  log[非酶管OD-空白管OD]-log[樣品管OD-空白管OD]

  = ────────────────────────

  3min×0.004mL

  組織GSH-Px比活力單位 規定每毫克蛋白質,每分鐘,扣除非酶反應,使GSH濃度降低1μmol/L為一個酶活力單位。

  (非酶管OD-樣品管OD)×A**×5

  組織GSH-Px比活力單位(U/mg蛋白) = ───────────────────

  3min×樣品蛋白質的mg數 *

  * Folin法或雙縮脲法測樣品蛋白質含量

  標準GSH濃度(μmol/L)

  ** A= ─────────── 即標準曲線斜率。

  標準GSH光密度(OD)

  1.3.6.2.4 注意事項

  1.3.6.2.4.1 由於H2O2易分解導致濃度改變,臨用時取貯備液用分光光度計測其濃度,取貯備液3mL,測定1cm光徑的240nm處OD值。

  OD

  濃度(mmol/L)=————————

  0.036(消光係數)

  若OD值為0.45,則表明H2O2濃度為12.5mmol/L。

  1.3.6.2.4.2 5-硫代2-硝基苯甲酸陰離子的顯色不僅與整個反應體系中氫離子濃度有關,還受反應時間限制。加入顯色劑后,反應體系pH為6.5時,11min開始顯色,此時比色5min內讀數準確。

  1.3.7抗氧化物質還原型谷胱甘肽(GSH)測定

  谷胱甘肽是一種低分子清除劑,它可清除O2-、H2O2、LOOH。谷胱甘肽是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的一種三肽,是組織中主要的非蛋白質的巰基化合物,是GSH-PX和GST兩種酶類的底物,為這兩種酶分解氫過氧化物所必需,它能穩定含巰基的酶,和防止血紅蛋白及其它輔助因子受氧化損傷,缺乏或耗竭GSH會促使許多化學物質或環境因素產生中毒作用,GSH量的多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素。

  1.3.7.1血或組織中還原型谷胱甘肽(GSH)測定方法

  1.3.7.1.1原理

  GSH-和5,5'-二硫對硝基甲酸(DTNB)反應在GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基甲酸陰離子,於420nm波長有最吸收峰,測定該離子濃度,即可計算GSH的含量。

  1.3.7.1.2儀器和試劑

  儀器:可見光分光光度計、酶標儀、低溫高速離心機、勻漿器、恆溫水浴鍋、微量加樣器

  試劑:0.9%生理鹽水

  4%磺基水楊酸溶液

  0.1mol/L PBS溶液(pH=8.0):

  稱取Na2HPO4 13.452g,KH2PO4 0.722g,加蒸餾水至1000mL。

  0.004%DTNB溶液:

  稱取DTNB 40mg溶於1000mL的0.1mol/L PBS溶液(pH=8.0)中。

  疊氮納緩衝液:

  
NaN316.25 mg
EDTA-Na27.44 mg
Na2HPO41.732 g
NaH2PO41.076 g
 加蒸餾水至1000mL,用少量HCl、NaOH調pH7.0,4℃保存。

  標準溶液:稱取還原型GSH 15.4mg,加疊氮納緩衝液至50mL,終濃度為 1mmol/L,臨用前配製。

  1.3.7.1.3 實驗步驟

  1.3.7.1.3.1 樣品製備:

  溶血液上清液:取0.1mL抗凝全血加雙蒸水0.9mL(1:9溶血液),充分混勻,直至透亮為止。取溶血液0.5mL加4%磺基水楊酸0.5mL混勻,室溫下3500rpm離心10分鐘,取上清液備用。

  血清上清液:取0.1mL血清加4%磺基水楊酸0.1mL混勻,室溫下3500rpm離心10分鐘,取上清液備用。

  組織上清液:取組織0.5g加生理鹽水4.5mL充分研磨成細漿(10%肝勻漿),混勻后取漿液0.5mL加4%磺基水楊酸0.5mL混勻,室溫下3500rpm離心10分鐘,取上清液備用。

  1.3.7.1.3.2 樣品測定:

  溶血液或組織樣品測定:

  
​測定管空白管
上清液0.5mL
4%磺基水楊酸0.5mL
DTNB4.5mL4.5mL
 混勻,室溫放置10 分鐘后,420nm處測定吸光度。

  血清樣品測定:

  
​測定管空白管
上清液0.1mL
4%磺基水楊酸0.1mL
DTNB0.9mL0.9mL
 混勻,室溫放置10 分鐘后,420nm處測定吸光度。

  註:該指標檢測,需新鮮樣品取材后當天完成。用雙縮脲法測定血清(或溶血液)、組織勻漿蛋白質含量。如用試劑盒,可按試劑盒的操作要求進行。

  1.3.7.1.3.3 標準曲線

  取1mmol/L GSH標準溶液0、10、20、50、100、150、200µL,分別加入生理鹽水至0.5mL,即得到0、20、40、100、200、300、400µmol/L的GSH標準液系列,各管加入DTNB4.5mL,混勻,室溫放置10 分鐘后,空白管調零,420nm處測定吸光度。以濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,做標準曲線。

  
​1234567
1mmol/L GSH(mL)00.010.020.050.100.150.20
生理鹽水(mL)0.500.490.480.450.400.350.30
DTNB(mL)4.504.504.504.504.504.504.50
GSH量(mmol/L)02040100200300400
 1.3.7.1.3.4 計算

  樣品GSH含量 = 對應曲線濃度值(mmol/L)×溶血液稀釋倍數×上清液稀釋倍數

  (mmol /L全血) = 對應曲線濃度值(mmol/L)×10×2

  樣品GSH含量 = 對應曲線濃度值(mmol/L)×上清液稀釋倍數

  (mmol /L血清) = 對應曲線濃度值(mmol/L)×2

  樣品GSH含量 = 對應曲線濃度值(mmol/L)×上清液稀釋倍數÷上清液組織含量

  (mmol /g組織) = 對應曲線濃度值(mmol/L)×2÷100g組織/L

  樣品GSH含量 = 對應曲線濃度值(mmol/L)×上清液稀釋倍數÷上清液蛋白含量

  (mmol /gprot) = 對應曲線濃度值(mmol/L)×2÷勻漿gprot/L

  1.4數據處理與結果判定

  1.4.1數據處理

  一般採用方差分析,但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗,方差齊,計算F值,F值< F0.05,結論:各組均數間差異無顯著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計;對非正態或方差不齊的數據進行適當的變數轉換,待滿足正態或方差齊要求后,用轉換后的數據進行統計;若變數轉換后仍未達到正態或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統計。

  1.4.2 指標判定

  1.4.2.1脂質氧化產物

  受試樣品組與模型(或老齡)對照組比較,過氧化脂質(丙二醛或8-表氫氧異前列腺素)含量降低有統計學意義,判定該受試樣品有降低脂質過氧化作用,該項指標結果陽性。

  1.4.2.2蛋白質氧化產物

  受試樣品組與模型(或老齡)對照組比較,蛋白質羰基含量降低有統計學意義,判定該受試樣品有降低蛋白質過氧化作用,該項指標結果陽性。

  1.4.2.3抗氧化酶活力

  受試樣品組與模型(或老齡)對照組比較,抗氧化酶(SOD或GSH-PX)活力升高有統計學意義,判定該受試樣品有升高抗氧化酶活力作用,該項指標結果陽性。

  1.4.2.4抗氧化物質GSH

  受試樣品組與模型(或老齡)對照組比較,GSH含量升高有統計學意義,判定該受試樣品有升高抗氧化物質GSH作用,該項指標結果陽性。

  1.4.3結果判定

  過氧化脂質含量、蛋白質羰基、抗氧化酶活性、還原性谷胱甘肽四項指標中三項指標陽性,可判定該受試樣品抗氧化動物實驗結果陽性。

  2 人體試食試驗

  2.1 受試者納入標準

  選年齡在18-65歲,身體健康狀況良好,無明顯腦、心、肝、肺、腎、血液疾患,無長期服藥史,志願受試保證配合的人群。

  2.2 排除受試者標準

  2.2.1妊娠或哺乳期婦女,對保健食品過敏者。

  2.2.2合併有心、肝、腎和造血系統等嚴重疾病患者。

  2.2.3短期內服用與受試功能有關的物品,影響到對結果的判斷者。

  2.2.4不符合納入標準,未按規定食用受試樣品,無法判定功效或資料不全影響功效或安全性判斷者。

  2.3 受試者分組

  對受試者按MDA、SOD、GSH-Px水平隨機分為試食組和對照組,儘可能考慮影響結果的主要因素如年齡、性別、生活飲食習慣等,進行均衡性檢驗,以保證組間的可比性。每組受試者不少於50例。

  2.4 試驗方法

  採用自身和組間兩種對照設計。試驗組按推薦服用方法、服用量每日服用受試產品,對照組可服用安慰劑或採用陰性對照。受試樣品給予時間3個月,必要時可延長至6個月。試驗期間對照組和試食組原生活、飲食不變。

  2.5 觀察指標

  各項指標在試驗開始及結束時各檢測1次。

  2.5.1 安全性指標

  2.5.1.1 一般狀況 包括精神、睡眠、飲食、大小便、血壓等

  2.5.1.2 血、尿、便常規檢查

  2.5.1.3 肝、腎功能檢查

  2.5.1.4 胸透、心電圖、腹部B超檢查

  2.5.2功效指標

  2.5.2.1 過氧化脂質含量 觀察試驗前後MDA的變化及MDA下降百分率。(測定方法見1.3.3.1)

  試驗前MDA — 試驗后MDA

  MDA下降百分率= &acute;100%

  試驗前MDA

  觀察試驗前後8-Isoprostane的變化及8-Isoprostane下降百分率。(測定方法見2.8)

  試驗前8-Isoprostane — 試驗后8-Isoprostane

  8-Isoprostane下降百分率= &acute;100%

  試驗前8-Isoprostane

  2.5.2.2 超氧化物歧化酶 觀察試驗前後SOD的變化及SOD升高百分率。(測定方法見1.3.4.1)

  試驗前SOD — 試驗后SOD

  SOD升高百分率= &acute;100%

  試驗前SOD

  2.5.2.3 谷胱甘肽過氧化物酶 觀察試驗前後GSH-PX的變化及GSH-PX升高百分率。(測定方法見2.7)

  試驗前GSH-PX — 試驗后GSH-PX

  GSH-PX升高百分率= ×100%

  試驗前GSH-PX

  2.6數據處理和結果判定

  凡自身對照資料可以採用配對t檢驗,兩組均數比較採用成組t檢驗,後者需進行方差齊性檢驗,對非正態分佈或方差不齊的數據進行適當的變數轉換,待滿足正態方差齊后,用轉換的數據進行t檢驗;若轉換數據仍不能滿足正態方差齊要求,改用t』檢驗或秩和檢驗;但變異係數太大(如CV>50%)的資料應用秩和檢驗。在試驗前組間比較差異無顯著性的前提下,可進行試驗后組間比較。

  各功效觀察指標試驗前後自身比較和試食后組間比較均有統計學意義,方可判定該指標陽性。

  過氧化脂質含量、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶三項實驗中任二項實驗結果陽性,可判定該受試樣品具有抗氧化功能作用。

  2.7 血中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力測定

  2.7.1 原理

  谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是體內存在的一種含硒清除自由基和抑制自由基反應的系統。對防止體內自由基引起膜脂質過氧化特別重要,其活力以催化GSH氧化的反應速度,及單位時間內GSH減少的量來表示,GSH和5,5』-二硫對硝基苯甲酸(DTNB)反應在GSH-Px催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基苯甲酸陰離子,於423nm波長有最大吸收峰,測定該離子濃度,即可計算出GSH減少的量,由於GSH能進行非酶反應氧化,所以最後計算酶活力時,必須扣除非酶反應所引起的GSH減少。

  2.7.2 試劑和儀器

  儀器:可見光分光光度計、酶標儀、恆溫水浴鍋、微量加樣器、離心機

  試劑:疊氮鈉磷酸緩衝液 pH7.0

  
NaN316.25mg終濃度2.5mmol/L
EDTA-Na27.44mg終濃度0.2mmol/L
Na2HPO41.732g終濃度0.2mol/L
NaH2PO41.076g終濃度0.2mol/L
 加蒸餾水至100mL,用少量HCL、NaOH調pH7.0,4℃保存。

  1mmol/L谷胱甘肽(還原型GSH)溶液

  GSH 30.7mg加疊氮鈉磷酸緩衝液至100mL,臨用前配製,冰凍保存1-2日。

  1.25-1.5mmol/L H2O2溶液

  取30%H2O2 0.15-0.17mL,用雙蒸水稀釋至100mL,作為貯備液,4℃避光保存,臨用前將貯備液用雙蒸水稀釋10倍即可。

  偏磷酸沉澱液

  
HPO316.7g(先用蒸餾水溶解)
EDTA0.5g
NaCl280g
 加蒸餾水至1000mL,用普通濾紙過濾,室溫保存。

  0.32mol/L Na2HPO4溶液:

  Na2HPO4 22.7g加蒸餾水至500mL,室溫保存。

  DTNB顯色液

  
DTNB40mg
檸檬酸三鈉1.0g
 加蒸餾水至100mL,4℃避光保存1個月。

  2.7.3 實驗步驟

  2.7.3.1 樣品製備

  溶血液:取血20μl加入到1mL 雙蒸水中,充分振搖,使之全部溶血1:100待測,4小時內測定酶活力。若當天來不及測定,將肝素抗凝全血置-20℃凍存,3天內測定,若4℃存放,28小時內必須測完。測前取出樣品室溫自然解凍,

  2.7.3.2 GSH標準曲線的製作:

  取1.0mmol/L GSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,分別置於10mL小容器瓶中,各加入偏磷酸沉澱劑8mL,用雙蒸水稀釋至10mL刻度,即得到濃度為0、20、40、60、80、100μmol/L的 GSH標準液。

  取上述不同濃度標準液各2mL,放入試管中,加入0.32mol/L Na2HPO4 2.5mL,比色前加入DTNB顯色液0.5mL用光徑1cm杯,5min內在可見光423nm波長測OD值,以雙蒸水調零點。

  以GSH含量(μmol/L)為橫坐標,OD423值為縱坐標,繪製標準曲線。

  2.7.3.3 測定步驟:

  
試劑樣品管(mL)非酶管(mL)&#8203;
1.0mmol/L GSH0.40.4&#8203;
血樣稀釋液0.4&#8203;&#8203;
雙蒸水 *&#8203;0.4&#8203;
37℃水浴預溫5min
H2O2(37℃預熱)0.20.2&#8203;
37℃水浴準確反應5min(嚴格控制時間)
偏磷酸沉澱液44&#8203;
3000r/min離心10min
離心上清液22&#8203;
雙蒸水&#8203;&#8203;&#8203;
偏磷酸沉澱液&#8203;&#8203;&#8203;
0.32mol/L Na2HPO42.52.5&#8203;
DTNB顯色液0.50.5&#8203;
 顯色反應1min後於423nm波長(1cm光徑),讀OD值,5min之內讀數準確。

  2.7.3.4 計算

  全血GSH-Px活力單位 規定每8μl全血,在37℃反應5min,扣除非酶反應后,使GSH濃度降低1μmol/L濃度為一個酶活力單位。

  全血GSH-Px活力U/mL血=(非酶管OD-樣品管OD)×A*×5**

  標準GSH濃度(μmol/L)

  * A=──────────── 即標準曲線的斜率

  標準GSH光密度(OD)

  ** 5 換算成1mL反應液中GSH濃度時,需乘以稀釋倍數5

  2.7.3.5 注意事項

  2.7.3.5.1 由於H2O2易分解導致濃度改變,臨用時取貯備液用分光光度計測其濃度,取貯備液3mL,測定1cm光徑的240nm處OD值。

  OD

  濃度(mmol/L)=─────────

  0.036(消光係數)

  若OD值為0.45,則表明H2O2濃度為12.5mmol/L。

  2.7.3.5.2 5-硫代2-硝基苯甲酸陰離子的顯色不僅與整個反應體系中氫離子濃度有關,還受反應時間限制。加入顯色劑后,反應體系pH為6.5時,11min開始顯色,此時比色5min內讀數準確。

  2.8 血清中8-表氫氧-異前列腺素(8-Isoprostane)測定

  2.8.1原理

  8-表氫氧-異前列腺素(8-Isoprostane)是體內脂質氧化應激反應穩定而具有特異性的標誌物,其含量能間接反應因機體內自由基的產生而導致組織細胞的脂質過氧化程度。

  2.8.2儀器與試劑

  儀器:酶標儀、生化培養箱、微量振蕩器、微量加樣器、洗板機

  試劑:8-Isoprostane KIA Kit (酶聯免疫試劑盒)

  8-Isoprostane EIA 抗體血清、8-Isoprostane AChE示蹤物、8-Isoprostane EIA標準品、EIA緩衝液、洗滌緩衝液、吐溫20、鼠抗-兔IgG抗體、EIA示蹤染色劑、EIA抗體血清染色劑、Ellman』s試劑

  2.8.3實驗步驟

  2.8.3.1樣品製備

  靜脈取血,3000r/min離心10min。取上清液,用EIA 緩衝液稀釋15倍備用。

  2.8.3.2樣品測定

  按試劑盒說明操作。

  8-表氫氧異前列腺素標準孔濃度分別為:500 pg/mL、200 pg/mL、80 pg/mL、32 pg/mL、12.8 pg/mL、5.1 pg/mL、2.0 pg/mL、0.8pg/mL

  
步驟試劑空白TANSBB0標準/樣品
1.加試劑EIA 緩衝液--100μL50μL-
標準/樣品----50μL
AChE示蹤物--50μL50μL50μL
抗體血清---50μL50μL
2.培養用封板膜蓋好酶標板,並在4℃避光條件下培養18小時
3.清洗清洗所有反應孔五次
4.加試劑AChE示蹤物-5μL---
Ellman』s200μL200μL200μL200μL200μL
5.培養用封板膜蓋好酶標板,並在常溫避光條件下培養45-90分鐘
6.讀數在波長412nm處測量各孔吸光度(B0在 0.3-1.0 A.U範圍)
 標準或樣品孔吸光度 — NSB孔吸光度

  %B/B0= ——————————————————×100

  B0孔吸光度 — NSB孔吸光度

  以標準物的濃度的對數(log)為橫坐標,%B/B0為縱坐標繪製標準曲線,亦可將數據轉換成logit(B/B0)或ln&#91;B/B0/(1-B/B0)&#93;做為縱坐標繪製標準曲線,計算回歸方程。將樣品的%B/B0值,代入方程式,計算出樣品的濃度,再乘以稀釋倍數,即為樣品中的8-表氫氧異前列腺素濃度。

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