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抗體晶元是蛋白晶元的一種,具有微型化、集成化、高通量化的特點,可以用於檢測某一特定的生理或病理過程相關蛋白的表達丰度,目前主要用於信號轉異、蛋白質組學、腫瘤及其他疾病的相關研究。

1新一代蛋白研究工具――抗體晶元

蛋白組學研究是即基因組學研究后的生命科學發展的一個大方向之一。蛋白質的結構和功能最終直接影響著生命活動的變化,基因轉錄水平的研究只能在一定程度上反映基因表達產物的變化,而真正發揮功能的蛋白要經過轉錄后加工、翻譯調控以及翻譯后加工等許多步驟和調控才能形成,因而對蛋白質的直接研究才能真實的解釋各種生命現象。但是目前研究蛋白質的手段和方法還沒有很大的發展,所以尋找有效、快捷的蛋白分析技術成為了至關重要的一個環節。
蛋白晶元技術的出現給蛋白組學研究帶來新思路。蛋白組學研究中一個主要的內容就是要研究在不同生理狀態或病理狀態下蛋白水平的量變,微型化,集成化,高通量化的抗體晶元就是一個非常好的研究工具,它也是蛋白晶元中發展最快的晶元,而且在技術上已經日益成熟。這些抗體晶元有的已經在向臨床應用上發展,比如腫瘤標誌物抗體晶元等,還有很多已經用在研究的各個領域裡。
第一張商品化的抗體晶元是由美國BD Clontech公司推出的。這是一張用於研究的抗體晶元,晶元上排列了378種已知蛋白的單抗(Ab Microarray 380, 目錄號 K1847-1),這些單抗對應的蛋白都是細胞結構和功能上十分重要的蛋白,涉及信號傳導、腫瘤、細胞周期調控、細胞結構、細胞凋亡和神經生物學等廣泛的領域。通過這張晶元,我們在一次實驗中就能夠比較幾百種蛋白的表達變化。
Ab Microarray 380上抗體是經過精心挑選的,這些抗體不僅可以識別人源的蛋白,對小鼠和大鼠樣品同樣有效。另外,每個抗體的結合親和力都經過了實驗測定,從多種抗體來源的克隆中篩選出反應特異性好,交叉反應程度小,信號明顯的抗體,並且還要保證信號與抗原濃度有著良好的線性關係。優化的抗體探針才可以保證反應的特異和靈敏(可檢測20pg/ml的抗原濃度)。晶元的檢測是用熒光報告分子,常用的熒光掃描儀都能夠完成。
第一代的蛋白晶元和DNA晶元一樣是作為一種定性分析的工具,可用於分析樣品之間相關蛋白的相對表達丰度;還可以作為DNA晶元的補充,用於研究蛋白和基因表達之間的關係。

2操作流程

Ab Microarray 380抗體晶元並不要求特殊的實驗操作,只要一般常規的操作就可以完成以往極為複雜耗時的工作。整個操作流程包括:從50—200mg組織或細胞、體液中進行蛋白質抽提——用Cy5和Cy3兩種不同顏色的熒光分子分別標記兩個樣品——洗去多餘的標記分子——與晶元雜交孵育——掃描分析結果。整個過程從樣品製備到結果分析只要一天即可完成,你只要準備好樣品、熒光染料、脫鹽純化柱(處理體液樣品時用)和熒光掃描儀,其他的試劑全部由試劑盒提供。
優化的試劑
隨晶元試劑盒提供的蛋白抽提/標記緩衝液,是專門為抗體晶元而設計的,非常溫和的去垢劑在能高效抽提膜結合蛋白(相比SDS煮沸法能抽提95%以上的蛋白)的同時能保持蛋白的天然活性(非變性條件),這樣能夠保證抽提的蛋白的溶解性和代表性,保證以後的實驗結果的真實性,和原始材料的一致性。
Internally Normalized Ratio
內源標準化處理可以得到一個內源標準化信噪比(INR),內源標準化處理是指對兩個樣品(A、B)中分別用兩種熒游標記分子(Cy3和Cy5)標記,並交叉與晶元雜交(見圖,A-Cy5和B-Cy3一組,A-Cy3和B-Cy5一組分別和晶元雜交),可以作為消除抗原—抗體結合效率差異的對照,也可以消除潛在的不同熒光分子的標記效率差異。假如Cy5標記效率高於Cy3,單純一個實驗的結果就會有偏差(Cy5標記的樣品信號偏高),用這種雙向交叉反應就可以消除這種偏差。兩晶元雜交結果分別得到兩組Ratio值,通過免費下載的工具就可以自動算出每個抗體抗原的INR值,這就代表在兩個樣品間某個蛋白的相對丰度。這種內源標準化處理可以大大減小樣品分析的偏差。
抗體晶元檢測的結果不是蛋白的絕對含量而是378個目的蛋白在兩個樣品之間的相對丰度。值得注意的是由於抗體抗原結合的差異、標記差異等原因,根據晶元結果信號的強弱判斷同一樣品中兩種不同蛋白的多少是不恰當的。

蛋白晶元技術的基本原理

蛋白晶元技術的基本原理是將各種蛋白質有序地固定於滴定板、濾膜和載玻片等各種載體上成為檢測用的晶元,然後,用標記了特定熒光抗菌素體的蛋白質或其他成分與晶元作用,經漂將未能與晶元上的蛋白質互補結合的成分洗去,再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術,測定晶元上各點的熒光強度,通過熒光強度分析蛋白質與蛋白質之間相互作用的關係,由此達到測定各種蛋白質功能的目的。為了實現這個目的,首先必須通過一定的方法將蛋白質固定於合適的體上,同時能夠維持蛋白質天然構象,也就是必須防止其變性以維持其原有特定的生物活性。另外,由於生物細胞中蛋白質的多樣性和功能的複雜性,開發和建立具有多樣品并行處理能力、能夠進行快速分析的高通量蛋白芯處技術將有利於簡化和加快蛋白質功能研究的進展。

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