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黃酮類化合物如此廣泛分佈於植物界中,而且生理活性多種多樣。

1 松針黃酮 -簡介

黃酮類化合物
  黃酮類化合物廣泛存在於自然界,是一類重要的天然有機化合物。其不同的顏色為天然色素家族添加了更多的色彩。這類含有氧雜環的化合物多存在於高等植物及羊齒類植物中。苔類中含有的黃酮類化合物為數不多,而藻類、微生物、細菌中沒有發現黃酮類化合物。黃酮類化合物的存在形式既有與糖結合成苷的,也有遊離體。
  黃酮類化合物如此廣泛分佈於植物界中,而且生理活性多種多樣,據不完全統計,其主要生理活性表現在:①對心血管系統的作用。②抗肝臟毒作用。③抗炎作用。④雌性激素樣作用。⑤抗菌及抗病毒作用。③瀉下作用。①解痙作用等。因而引起了國內外的廣泛重視,研究進展很快。僅截止到1974年,國內外報道發現的黃酮類化合物共1674個(主要是天然黃酮類,也有少部分為合成品,其中苷元902個,苷722個),並以黃酮醇類最多;約佔總數的三分之一,其次為黃酮類,佔總數的四分之一以上,其餘則較少。至於雙黃酮類多局限分佈於裸子植物,尤其松柏綱、銀杏綱和鳳尾綱等植物中。截止到1993年統計,黃酮類化合物總數已超過4000個。


黃酮類化合物理化性質
不論在黃酮類化合物的提取分離方面還是在其結構測定的研究方面,黃酮類化合物的理化性質及其顯色反應都發揮著譜學技術所替代不了的作用。下面僅就其與分離和結構測定密切相關的性質進行簡要介紹。
一、性狀
黃酮類化合物多為結晶性固體,少數(如黃酮苷類)為無定形粉末。遊離的各種苷元母核中,除二氫黃酮、二氫黃酮醇、黃烷及黃烷醇有族光性外,其餘則無光學活性。苷類由於在結構中引入糖的分子,故均有旋光性,且多為左旋。黃酮類化合物的顏色與分子中是否存在交叉共軛體系及助色團(-OH、-OCH3等)的種類、數目以及取代位置有關。以黃酮為例,其色原酮部分原本元色;但在2位上引入苯環后,即形成交叉共軛體系,並通過電子轉移、重排,使共軛鏈延長,因而顯現出顏色。一般情況下,黃酮、黃酮醇及其苷類多顯灰黃~黃色,查耳酮為黃~橙黃色,而二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮類,因不具有交叉共軛體系或共軛鏈短,故不顯色(二氫黃酮及二氫黃酮醇)或顯微黃色(異黃酮)。顯然,在上述黃酮、黃酮醇分子中,尤其在7位及4』位引入-OH及-OCH3等助色團后,則因促進電子移位、重排,而使化合物的顏色加深。但-OH、-OCH3,引入其他位置則影響較小。
花色素及其苷元的顏色隨pH不同而改變,一般顯紅( pH < 7)、紫( pH= 8.5)藍( pH> 8.5)等顏色。
二、溶解性
黃酮類化合物的溶解度因結構及存在狀態(苷和苷元、單糖苷、雙糖苷或三糖苷)不同而有很大差異。一般遊離苷元難溶或不溶於水,易溶於甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙醇等有機溶劑及稀鹼水溶液中。其中黃酮、黃酮醇、查耳酮等平面性強的分子,因分子與分子間排列緊密,分子間引力較大,故更難溶於水;而二氫黃酮及二氫黃酮醇等,因系非平面性分子,故分子與分子間排列不緊密,分子間引力降低,有利於水分子進入,溶解度稍大。
至於花色苷元(花青素)類雖也為平面性結構,但因以離子形式存在,具有鹽的通性,故親水性較強,水中溶解度較大。
黃酮類苷元分子中引入羥基,將增加在水中的溶解度;而羥基經甲基化后,則增加在有機溶劑中的溶解度。例如,一般黃酮類化合物不溶於石油醚中,故可與脂溶性雜質分開,但川陳皮素(5,6,7,8,3』,4』-六甲氧基黃酮)卻可溶於石油醚。
黃酮類化合物的羥基糖苷化后,水中溶解度即相應加大,而在有機溶劑中的溶解度則相應減小。黃酮苷一般易溶於水、甲醇、乙醇等強極性溶劑中;但難溶或不溶於苯、氯仿等有機溶劑中。糖鏈越長,則水中溶解度越大。
另外,糖的結合位置不同,對苷的水中溶解度也有一定影響:以棉黃素(3,5,7,8,3』,4』-六羥基黃酮)為例,其3-O-葡萄糖苷的水中溶解度大於7-O-葡萄糖苷。
三、酸性與鹼性
(一)酸性
黃酮類化合物因分子中多具有酚羥基,故顯酸性,可溶於鹼性水溶液、吡啶、甲醯胺及二甲基甲醯胺中。
由於酚羥基數目及位置不同,酸性強弱也不同,以黃酮為例,其酚羥基酸性強弱順序依次為:
            7,4』-二羥基>7或4'-羥基>一般酚羥基>5-羥基
例如C7-OH因為處於C=O的對位,在p-共軛效應的影響下,酸性較強,可溶於碳酸鈉水溶液中,此性質可用於提取、分離及鑒定工作。
(二)鹼性
7-吡喃環上的1位氧原子,因有未共用的電子對,故表現微弱的鹼性,可與強無機酸,如濃硫酸、鹽酸等生成鹽,但生成的樣鹽極不穩定,加水后即可分解。
黃酮類化合物溶於濃硫酸中生成的樣鹽,常常表現出特殊的顏色,可用於鑒別。某些甲氧基黃酮溶於濃鹽酸中顯深黃色,且可與生物鹼沉澱試劑生成沉澱。
四、顯色反應
黃酮類化合物的顏色反應多與分子中的酚羥基及γ~吡喃酮環有關。                          
(一)還原試驗
1.鹽酸-鎂粉(或鋅粉)反應 這是鑒定黃酮類化合物最常用的顏色反應。方法是將樣品溶於 1.0 ml甲醇或乙醇中,加入少許鎂粉(或鋅粉)振搖,滴加幾滴濃鹽酸,1~2 min內(必要時微熱)即可顯色。多數黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇類化合物顯橙紅至紫紅色。少數顯紫至藍色,當B環上有-OH或-OCH3取代時,呈現的顏色隨之加深。但查耳酮、橙酮、兒茶素類則無該顯色反應。異黃酮類除少數例外,也不顯色。
由於花青素及部分橙酮、查耳酮等在單純濃鹽酸中也會發生色變,故須預先作空白對照實驗(在供試液中僅加入濃鹽酸進行觀察)。
另外,在用植物粗提取液進行預試時,為了避免提取液本身顏色的干擾,可注意觀察加入濃鹽酸后升起的泡沫顏色。如泡沫為紅色,即示陽性。
鹽酸-鎂粉反應的機理過去解釋為由於生成了花色苷元所致,現在認為是因為生成了陽碳離子緣故。
2.四氫硼鈉(鉀)反應NaBH4是對二氫黃酮類化合物專屬性較高的一種還原劑。
與二氫黃酮類化合物產生紅至紫色。其他黃酮類化合物均不顯色,可與之區別。方法是在試管中加入0.1ml含有樣品的乙醇液,再加等量 2% NaBH4的甲醇液,lmin后,加濃鹽酸或濃硫酸數滴,生成紫色至紫紅色。
另外,近來報道二氫黃酮可與磷鉬酸試劑反應呈現棕褐色,也可作為二氫黃酮類化合物的特徵鑒別反應。
(二)金屬鹽類試劑的絡合反應
黃酮類化合物中常含有下列結構單元,故常可與鋁鹽、鉛鹽、諸鹽、鎂鹽等試劑反應,生成有色絡合物。   
1.鋁鹽 常用試劑為 1%三氯化鋁或硝酸鋁溶液。生成的絡合物多為黃色,並有熒光,可用於定性及定量分析。
2.鉛鹽 常用工%醋酸鉛及鹼式醋酸鉛水溶液,可生成黃至紅色沉澱。
黃酮類化合物與鉛鹽生成沉澱的色澤,因羥基數目及位置不同而異。其中,醋酸鉛只能與分子中具有鄰二酚羥基或兼有3-羥基、4-酮基或5-羥基、4-酮基結構的化合物反應生成沉澱。但鹼式醋酸鉛的沉澱能力要大得多,一般酚類化合物均可與其發生沉澱,依此不僅可用於鑒定,也可用於提取及分離工作。
3.鋯鹽 多用2%二氯氧鋯甲醇溶液 黃酮類化合物分子中有遊離的3-或5-羥基存在時,均可與該試劑反應生成黃色的鋯絡合物。但兩種鋯絡合物對酸的穩定性不同。3-羥基,4-酮基絡合物的穩定性比5-羥基,4-酮基絡合物的穩定性強(僅二氫黃酮醇除外)故當反應液中接著加入枸椽酸后,5-羥基黃酮的黃色溶液顯著褪色,而3-羥基黃酮溶液仍呈鮮黃色(鋯-枸椽酸反應)。方法是取樣品 0.5~1.0 mg,用10.0 ml甲醇加熱溶解,加1.0ml2%二氯氧鋯( ZrOCl2)甲醇液,呈黃色后再加入2%枸椽酸甲醇溶液,觀察顏色變化。
上述反應也可在紙上進行,得到的鋯鹽絡合物多呈黃綠色,並帶熒光。
4.鎂鹽 常用醋酸鎂甲醇溶液為顯色劑,本反應可在紙上進行。試驗時在紙上滴加
一滴供試液,噴以醋酸鎂的甲醇溶液,加熱乾燥,在紫外光燈下觀察。二氫黃酮、二氫黃酮醇類可顯天藍色熒光,若具有C3-OH,色澤更為明顯。而黃酮、黃酮醇及異黃酮類等則顯黃-橙黃-褐色。
5.氯化鍶(SrCl2)
在氨性甲醇溶液中,氯化鍶可與分子中具有鄰二酚羥基結構的黃酮類化合物生成綠色至棕色乃至黑色沉澱。
具有鄰二酚羥基的黃酮類化合物與SrCl2的反應試驗時,取約1.0 mg檢品置小試管中,加入1.0 ml甲醇使溶(必要時可在水浴上加熱),加入3滴0.01 mol/L。氯化鋁的甲醇溶液,再加3滴已用氨蒸氣飽和的甲醇溶液,注意觀察有無沉澱生成。
6.三氯化鐵    三氯化鐵水溶液或醇溶液為常用的酚類顯色劑。多數黃酮類化合物因分子中含有酚羥基,故可產生陽性反應,但一般僅在含有氫鍵締合的酚羥基時,才呈現明顯反應。
(三)硼酸顯色反應
當黃酮類化合物分子中有下列結構時,在無機酸或有機酸存在條件下,可與硼酸反應,生成亮黃色。顯然,5-羥基黃酮及2-羥基查耳酮類結構可以滿足上述要求,故可與其他類型區別。一般在草酸存在下顯黃色並具有綠色熒光,但在枸椽酸丙酮存在的條件下,則只顯黃色而無熒光。
(四)鹼性試劑顯色反應
在日光及紫外光下,通過紙斑反應,觀察樣品用鹼性試劑處理后的顏色變化情況,對於鑒別黃酮類化合物有一定意義。其中,用氨蒸氣處理后呈現的顏色變化置空氣中隨即褪去,但經碳酸鈉水溶液處理而呈現的顏色置空氣中卻不褪色。
此外,利用鹼性試劑的反應還可幫助鑒別分子中某些結構特徵。例如:
(1)二氫黃酮類易在鹼液中開環,轉變成相應的異構體-查耳酮類化合物,顯橙至黃色。
(2)黃酮醇類在鹼液中先呈黃色,通入空氣后變為棕色,因此可與其他黃酮類區別。
(3)黃酮類化合物當分子中有鄰二酚羥基取代或3,4』-二羥基取代時,在鹼液中不穩定,易被氧化,由黃色-深紅色-綠棕色沉澱。
五、黃酮類化合物的色譜檢識
(一)紙色譜法
紙色譜適合分離檢識各種類型黃酮類化合物,包括苷和苷元。雙向紙色譜能檢識植物粗提物中黃酮類化合物存在的最好方法之一。用雙向紙色譜分離檢識黃酮類化合物時,第一向通常用一種「醇性」展開劑,第二如t-BuOH─HOAc─H2O(3:1:1)等;向通常用一種「水性」展開劑,如2%~5%HOAc等。
  檢識黃酮類化合物苷元,通常用「醇性」展開劑。檢識苷往往用「水性」展開劑。
(二)薄層色譜法
薄層色譜法仍然是分離和檢出植物粗提物中黃酮類化合物的重要方法之一。一般採用吸附薄層,吸附劑大多用硅膠和聚醯胺。
硅膠薄層主要用於分離大多數苷元,也可用於分離苷。
  聚醯胺薄層色譜用於分離含遊離酚羥基的苷與苷元較好。由於聚醯胺對黃酮類化合物吸附能力較強,因此,展開劑需要較強的極性。在展開劑中大多含有醇、酸或水,或兼有兩者。
  纖維素薄層色譜分離黃酮苷元的溶劑系統有苯-乙酸-水(125∶72∶3)或氯仿-乙酸-水(10∶9∶1)。經典的溶劑系統即5%~40%乙酸、正丁醇-乙酸-水(4∶1∶5)等亦經常用於分離黃酮類化合物。
(三)高效液相色譜法
  黃酮類成分的色譜條件可分為正相色譜和反相色譜二類,正相色譜採用硅膠為固定相,親脂性溶劑為流動相,主要檢識親脂性較強的黃酮。也可採用氰基鍵合擔體為固定相。反相色譜多用C18鍵合柱為擔體,流動相常用甲醇-水或乙腈-水,或甲醇-乙腈-水,有時以一定pH的酸水或緩衝溶液代替水加入。

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