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氯黴素乙醯轉移酶

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1 氯黴素乙醯轉移酶 -概述

  氯黴素乙酞轉移酶(Chloramphenicol Acetyltransferase ,CAT)是一種原核酶類,可以將氯黴素乙酞化而使其

  失活,是細菌產生氯黴素抗性的主要原因。在大腸桿菌中易表達,而且非常穩定,因此,氯黴素乙酞轉移酶可被改造成檢測氯黴素的理想工具酶。不同種類的抗性細菌可以產生不同種類的氯黴素乙酞轉移酶,其中以CATⅠ,Ⅱ,Ⅲ研究的最多,這三者中又以CATⅠ對底物的親合性為最高。

2 氯黴素乙醯轉移酶 -CAT的功能

  細菌的氯黴素抗性和CAT有著直接的關係。當含有CAT的細菌暴露於氯黴素時,可以使氯黴素乙酞化而失活。

3 氯黴素乙醯轉移酶 -CAT的結構

概述

  最早對CAT結構的研究主要使用的是CATⅠ和CATⅢ的雜聚體,CAⅠ和CA』F1nⅡ亞基的分子量分別是25688

  和24965道爾頓,而CATⅢ的沉降平衡數據顯示其分子量為70500道爾頓,這證明CATⅢ是一個三聚體(αβ2和α2β)的結構。

  在CATⅢ三聚體中,每一亞基六條鏈的β片層結構延伸通過亞基交界面從而把每個亞基聯繫起來,確切地說是通過相鄰亞基地βH片層結構而聯繫起來的。在許多寡聚蛋白質中都有類似情況的這種延伸,但只通過一條鏈的延伸是相對不常見的。這種β片層結構延伸產生了總共8個主鏈氫鍵,這可能有利於CATⅢ三聚休結構的穩定性。亞基交界面具有與其他寡聚酶相似的其他特性。在三聚體形成的過程中大約亞基單體總面積的20%被掩埋,被掩埋面積的近似一半由疏水氨基酸組成,8個帶電的極性側鏈位於交界面,儘管只有其中的一個參與形成亞基內的

  離子偶。所有溶媒分子包括在交界面中被掩埋的5個被認為提供了重要的有利於穩定的交互作用。

  CATⅢl結合氯黴素的結構在1.75埃的解析度下已經被精確描述。六條平行和反平行的β片層結構構成亞基結構的主幹。5個α螺旋包裹在一側和片層結構的末端形成一種類似有餡但無上面一層的三明治結構。另外N末端以及α3螺旋與βE片層結構之間伸出的環形成了一個小的三鏈的β片層結構。這種二級結構排列方式在蛋白結構中並不多見,到目前為止還沒有發現其他蛋白具有CATⅢ的這種特殊摺疊排列的二級結構。

活性位點

  1、氯黴素結合位點

  氯黴素結合與定位在亞基交界面的一個深深的袋子結構中。儘管形成袋子結構的大多數氨基酸位於形成交界面的其中的一個亞基中,在催化中起關鍵作用的195位的組氨酸卻位於另外的一個亞基。氯黴素的苯環與29位亮氨酸,31位半胱氨酸,160亮氨酸,172位異亮氨酸的側鏈結合,其二氯基團和105位的丙氨酸,135位的苯丙氨酸,146位的天冬酞胺發生范德華力相互作用。輕基和乙酞胺與水分子形成氫鍵,這些氫鍵位於口袋結構極性的一側。酶與氯黴素之間只有兩個氫鍵相連,一個位於乙酞胺的氧與25位酪氨酸的經基側鏈之間,另一個位於氯黴素C3位的經基和195位組氨酸咪哇基的N3之間。距離氯黴素C3位的羥基3.5埃的範圍內存在兩個水分子。推測當發生乙酞化反應或者CAT與氯黴素或者氯黴素類似物結合時,這些水分子中的一個或者全部會被替換掉。與C1經基相連的三個或以上水分子在產生1乙酞氯黴素時也能被替換掉。

  在所有的CAT種類中形成結合位點的17個氨基酸中僅僅有5個是絕對保守的。一些位點的替換也不是保守的。儘管各種CAT催化效率差別很大,但都具有相似的氯黴素親和性。

  2、輔酶A結合位點

  CAT與CoA二元複合物的結構已經在2.4埃解析度下被描述過。酶的構象與在氯黴素和酶形成的二元複合物中的酶的構象基本相同,也與去輔基酶蛋白的構象基本相同,在去輔基酶蛋白中底物結合的口袋結構就己經有效的形成。CoA用其泛酞琉基乙胺臂結合在一種伸展的構象中,把其極性的磷酸基團放置在酶分子的表面與溶媒分子相接觸,但卻完全包埋掉其硫醇基團。腺嘌呤環結合在一個疏水口袋結構中,主鏈原子產生了兩個氫鍵,與水分子產生了第三個氫鍵,其產生氫鍵的能力達到了飽和。COA的大多數極性基團都形成了氫鍵,這些氫鍵的大多數是與有序的水分子而不是蛋白原子形成的。

  3、催化中心

  化學修飾研究更進一步確認了195位組氨酸在催化中的核心作用,而且認為其發揮了廣義鹼的作用,從氯黴素C3的經基上吸收質子,從而促使羥基氧攻擊CoA硫酯的羰基。在CAT與氯黴素的二元複合物結構中,195位組氨酸的咪唑基的N3距離氯黴素C3的輕基2.8埃。咪唑基的N1與其自身主鏈上的羰基氧形成氫鍵,有利於在高效催化過程中發生的互變異構現象的穩定性。在CAT與CoA二元複合物結構中,CoA的S距離195位咪唑基的N3隻有3.3埃。對模型結構的研究結果也提示148位保守絲氨酸在催化中發揮作用,絲氨酸的經基距離氯黴素C3的輕基有4.3埃的距離,因此不太可能在乙酞基轉移過程中發揮直接的作用。在四面體中間產物模型中,148位的絲氨酸和氧陰離子的距離只有3.2埃,在一個氫鍵距離的範圍內,推測它可能有利於過渡態穩定性。四面體結構模型中的氧陰離子通過一個溶媒水分子的作用和174位的蘇氨酸之間也有一個氫鍵。儘管這種交互作用不是直接的,但定點突變的研究結果表明174位的蘇氨酸在催化中的確發揮作用。

定點突變

  為了研究反應中底物識別,催化和特殊側鏈交互作用對蛋白結構各方面的影響,包括對其穩定性和反應活性的影響,CATⅢ己經有超過60種的定點突變類型。特殊的點突變類型有助於研究每一個酪氨酸殘基在配體結合時熒光發生改變的過程中所起的作用,有助於進一步的闡明CATⅢ和氯黴素交互作用的NMR結果。對cat基因實施隨機和定點突變將會對CATⅠ和CATⅢ的比較研究提供有用的實驗數據,對CAT結構的認識也會進一步的加深。

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