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流式細胞術(Flow Cytometry, FCM)是一種在功能水平上對單細胞或其他生物粒子進行定量分析和分選的檢測手段,它可以高速分析上萬個細胞,並能同時從一個細胞中測得多個參數,與傳統的熒光鏡檢查相比,具有速度快、精度高、準確性好等優點,成為當代最先進的細胞定量分析技術。

1簡介

一種在液流系統中,快速測定單個細胞或細胞器的生物學性質,並把特定的細胞或細胞器從
流式細胞術

  流式細胞術

群體中加以分類收集的技術。其特點是通過快速測定庫爾特電阻、熒光、光散射和光吸收來定量測定細胞 DNA含量、細胞體積、蛋白質含量、酶活性、細胞膜受體和表面抗原等許多重要參數。根據這些參數將不同性質的細胞分開,以獲得供生物學和醫學研究用的純細胞群體。目前最高分選速度已達到每秒鐘3萬個細胞。

2特點

1.測量速度快;2.可進行多參數測量;3.是一門綜合性的高科技方法( FCM綜合了光學,電子學,流體力學,細胞化學,免疫學,激光和計算機等多門學科和技術);4.既是細胞分析技術,又是精確的分選技術。

3工作原理

將待測細胞染色后製成單細胞懸液。用一定壓力將待測樣品壓入流動室,不含細胞的磷
流式細胞術

  流式細胞術

酸緩衝液在高壓下從鞘液管噴出,鞘液管入口方向與待測樣品流成一定角度,這樣,鞘液就能夠包繞著樣品高速流動,組成一個圓形的流束,待測細胞在鞘液的包被下單行排列,依次通過檢測區域。
流式細胞儀通常以激光作為發光源。經過聚焦整形后的光束,垂直照射在樣品流上,被熒光染色的細胞在激光束的照射下,產生散射光和激發熒光。這兩種信號同時被前向光電二極體和90°方向的光電倍增管接收。光散射信號在前向小角度進行檢測,這種信號基本上反映了細胞體積的大小;熒光信號的接受方向與激光束垂直,經過一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離,形成多個不同波長的熒光信號。
這些熒光信號的強度代表了所測細胞膜表面抗原的強度或其核內物質的濃度,經光電倍增管接收后可轉換為電信號,再通過模/數轉換器,將連續的電信號轉換為可被計算機識別的數字信號。計算機把所測量到的各種信號進行計算機處理,將分析結果顯示在計算機屏幕上,也可以列印出來,還可以數據文件的形式存儲在硬碟上以備日後的查詢或進一步分析。
檢測數據的顯示視測量參數的不同由多種形式可供選擇。單參數數據以直方圖的形式表達,其X軸為測量強度,Y軸為細胞數目。一般來說,流式細胞儀坐標軸的解析度有512或1024通道數,這視其模數轉換器的解析度而定。對於雙參數或多參數數據,既可以單獨顯示每個參數的直方圖,也可以選擇二維的三點圖、等高線圖、灰度圖或三維立體視圖。
細胞的分選是通過分離含有單細胞的液滴而實現的。在流動室的噴口上配有一個超高頻電晶體,充電后振動,使噴出的液流斷裂為均勻的液滴,待測定細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正負不同的電荷,當液滴流經帶有幾千伏特的偏轉板時,在高壓電場的作用下偏轉,落入各自的收集容器中,不予充電的液滴落入中間的廢液容器,從而實現細胞的分離。

4應用範圍

隨著對FCM研究的日益深入,其價值已經從科學研究走入了臨床應用階段,在中國臨床醫學領域裡已有著廣泛的應用。可用於白血病的分型、腫瘤細胞染色體的異倍性測定,以及免疫學研究,並已開
流式細胞術

  流式細胞術

始用於細菌鑒定,病毒感染細胞的識別和艾滋病感染者T4、T8細胞的記數。
自70年代以來,隨著流式細胞技術水平的不斷提高,其應用範圍也日益廣泛。流式細胞術已普遍應用於免疫學、血液學、腫瘤學、細胞生物學、細胞遺傳學、生物化學等臨床醫學和基礎醫學研究領域。
在臨床中的作用
FCM通過熒光抗原抗體檢測技術對細胞表面抗原分析,進行細胞分類和亞群分析。這一技術對於人體細胞免疫功能的評估以及各種血液病及腫瘤的診斷和治療有重要作用。有大量文章介紹了淋巴細胞亞群等在各種疾病中的變化。正常人群淋巴細胞T4/T8比值大約為2∶1,但在人體細胞免疫力低下時可出現比例倒置。用FCM還可以監測腎移植后病人的腎排斥反應,如果T4/T8比例倒置,病人預后良好,較少發生腎排異現象;反之排異危險性增加。同樣此種測定技術也用於艾滋病的診斷和治療中。還有作者報告了外周血淋巴細胞免疫表型的參考值,並對其種族、性別、年齡等影響因素進行了探討[5]。
目前FCM用的各種單克隆抗體試劑已經發展到了百餘種,可以對各種血細胞和組織細胞的表型進行測定分析。
在血栓與出血性疾病中的應用
(1)血小板功能的測定:正常情況下血小板以分散狀態在血管內運行,但當血管損傷、血流改變或受到化學物質刺激時血小板被活化而發生一系列改變。由於血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白表達水平的高低來判斷,FCM測定血小板膜糖蛋白的表達情況成為檢查血小板功能的一種新手段[11]。該方法靈敏、特異性高。如果採用全血法測定,只需微量標本,適合於兒童及血小板減少性疾病的患者[12]。 血小板活化時其質膜糖蛋白較其靜止期發生顯著改變,FCM可以通過單抗免疫熒游標記(血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa,CD62,CD63等)監測血小板功能及活化情況,有利於血栓栓塞性疾病的診斷和治療。
此外血小板活化時其細胞內的鈣離子濃度發生很大變化,藉助於鈣離子敏感熒光探針的幫助,用FCM測定鈣離子濃度,可以作為活化血小板監測的非免疫性指標。(2)血小板相關抗體的測定:免疫性血小板減少性紫癜病人血漿中可產生血小板自身抗體,結合在血小板表面,稱為血小板相關抗體,其分子可以是IgG、IgA或IgM,用羊抗人IgG、IgA、IgM熒光抗體標記被測血小板,FCM可以測定血小板相關抗體含量。直接法檢測血小板表面的相關抗體,間接法可測定血清中的相關抗體。該方法用於該病的診斷及治療監測,具有檢測速度快、靈敏度高的優點。
圖書信息
叢書名: 藥學實驗室技術系列
作 者: 賈永蕊 編
出版時間: 2009-3-1
版 次: 1
頁 數: 183
開 本: 16開
包 裝: 平裝
所屬分類: 圖書 >> 醫學 >> 藥學 >> 藥學理論

內容簡介

本書分為三篇,原理篇主要介紹了流式細胞術的原理和質量控制方法;操作篇詳細地介紹了流式細胞術細胞懸液的製備,以及在具體的各項應用中流式細胞術的操作方法與技巧:常見問題解答篇採用一問一答的方式,根據編寫人員的實踐經驗,對流式細胞術中常見的問題進行詳細解答。
內容涉及,應用流式細胞術進行:
細胞周期禾口DNA倍體分析
DNA雙參數分析
凋亡檢測
腫瘤細胞多葯耐葯檢測
細胞免疫表型分析
細胞因子的測定
與同類書相比,本書更加以實際經驗為基礎,突出實際操作技巧,採取Step-by-Step方式進行說明,使方法與技巧更易於掌握。
本書適用干醫藥、生命科學相關實驗室的技術人員及相關研究生。
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