1熒光原位雜交

應用背景
對於利用rRNA的熒光原位雜交來說,如下原因可導致較低的熒光信號強度
較低的細胞核糖體含量
較低的細胞周邊的通透性
較低的目標序列可接觸性(由於rRNA的摺疊產生的構象,有些位置與rRNA分子內其他鏈或其他rRNA或蛋白緊密接觸,從而使探針無法和目標序列雜交)
為檢驗細胞中的目標序列是否容易被探針雜交,及測試最佳雜交溫度,可利用「克隆熒光原位雜交」(clone-FISH)進行試驗:將rRNA基因結合入質粒,轉化至大腸桿菌中表達,構成核糖體,再用熒游標記的探針雜交。
FISH可與流式細胞術聯用,對特定熒游標記的細胞進行計數或者分離。
原理
FISH(fluorescence in situ hybridization)技術是一種重要的非放射性原位雜交技術。它的基本原理是:如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的,二者經變性-退火-復性,即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛,可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應,經熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。
特點
原位雜交的探針按標記分子類型分為放射性標記和非放射性標記。用同位素標記的放射性探針優勢在於對製備樣品的要求不高,可以通過延長曝光時間加強信號強度,故較靈敏。缺點是探針不穩定、自顯影時間長、放射線的散射使得空間解析度不高、及同位素操作較繁瑣等。採用熒游標記系統則可克服這些不足,這就是FISH技術。FISH技術作為非放射性檢測體系,有以下特點。
優點:1、熒光試劑和探針經濟、安全;2、探針穩定,一次標記后可在兩年內使用;3、實驗周期短、能迅速得到結果、特異性好、定位準確;4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列,其靈敏度與放射性探針相當;5、多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列;6、既可以在玻片上顯示中期染色體數量或結構的變化,也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結構。
缺點:不能達到100%雜交,特別是在應用較短的cDNA探針時效率明顯下降。
FISH 技術檢測位點數目及檢測目標的發展
在FISH 技術基本確立之後,FISH 不僅用於單基因或核酸檢測,FISH 技術的進一步發展擴展到多色FISH 多基因位點同時檢測,從基因檢測發展到基因組、染色體、活細胞中轉錄產物mRNAs 原位檢測以及組織水平的核酸檢測,並且在今後的研究中還有可能應用到整個生物體的檢測。早期的探針較大,是通過載體的增殖、缺口平移法、體外轉錄法和隨機引物DNA 合成法來製備以獲得特異性雜交克隆。然而大片斷的探針通常帶有重複序列造成高熒光背景,採用未標記的核酸進行預處理使其與非特異性位點結合用於抑制非特異性雜交可以克服上述問題,同時也使得研究者擴大了檢測目標,實現了整條染色體染色。在細胞遺傳學上FISH 技術在染色體分析方面也因此得到了顯著的提高。如通過比較基因組雜交(Comparativegenomic hybridization)用於檢測染色體區域的缺失和重複。大片段探針一旦和樣品非特異性結合就會形成一個信號,混淆染色體上基因的檢測,就需要剪切成小片段<200核苷酸。現在檢測手段的提高以及檢測軟體的不斷發展使得FISH技術的檢測要求越來越低,靈敏度越來越高。精確的計算機圖片處理演算法的不斷改進形成了亞顯微水平的探針高分辨技術。隨著檢測目標越來越小,FISH技術已用於隱蔽的亞端粒核型基因重排和精確的染色體作圖及單拷貝mRNA的檢測。
FISH 檢測範圍的擴大,使得FISH 技術的應用在20 世紀90 年代急速增長。由FISH 技術應用而形成的分支技術實現了越來越多的不同類型位點同時檢測。首先是採用不同的熒光素來檢測多位點,如雙色熒光用於檢測特異的核酸序列,每一條染色體、基因或者轉錄產物分別由一種可以分辨的熒光信號來表示。之後是採用兩種色彩解碼方案進一步擴大了FISH 應用範圍。解碼方案主要是針對色彩比例,即每一種顏色在總顏色中所佔的比例來描繪多位點。前述的每一種方法,或是兩種方法的結合都已經將可檢測位點多達12 個。採用計算機翻譯的五色方案可同時檢測出人類所有染色體代表著FISH 技術多位點檢測的里程碑。儘管可以採用多種方法觀測到mRNAs,但是FISH 對整個轉錄產物的原位分析似乎更有應用前景。色彩解碼技術已經實現了對整個組織的檢測。
FISH 技術檢測領域的發展
鑒於FISH 起始階段的發展主要是探針類型和檢測位點的擴展,熒光檢測技術將來的發展可能包括檢測領域的擴展。熒光圖像臨床診斷應用需要在檢測體系上進一步提高,如探針的結合,照相和分析的自動化,因此避免了不同操作間的誤差。樣品厚度是熒光顯微鏡檢測樣品類型的一個限制因素。近來的激光共聚焦顯微鏡和光學X射線斷層攝影技術要求樣品厚度達到1~2mm。一種改進的光學投射X 顯微斷層攝影技術可以獲取到15mm 厚樣品的圖像擴大了生物學和診斷樣品的檢測範圍。活細胞的RNAs FISH 技術檢測也有報道。既可以採用體內釋放的熒光集團也可以採用雜交后探針的熒光素進行檢測。這兩種新方法都可以降低非特異性標記探針存在時的高背景(如活細胞),可以用於追蹤mRNA 的合成和轉移途徑。這些方法較綠色熒光蛋白(Green fluorescence protein, GFP)更易於檢測不同靶分子。相對於GFP 活細胞原位雜交檢測,FISH 易受到細胞內合成探針的影響。FISH 需要進一步的改進以降低活體基因表達檢測時的干擾背景,避免細胞內自身雜交物的干擾。其實完全可以不必考慮FISH 檢測和熒光檢測蛋白技術的差異,將FISH 技術和熒光蛋白技術結合起來可以同時檢測目的核酸和蛋白。
多光子顯微技術的應用進一步擴大了熒光圖像的應用範圍。採用多光子顯微鏡,激光塊可以發射光子聚焦於顯微鏡兩到三次激發目的熒光素。採用近紅外激發光可以更深層次穿透生物樣品,比可見光對活體樣品造成的毒性低。這種新方法的應用已將熒光圖像用於活體系統的檢測,甚至整個動物體。由於還不能合成生物體標記探針,因此目前生物體內熒光圖像的應用只限於檢測熒光分子或生物體自發熒光。生物組織在正常的生理或者病理生理過程中產生的自發熒光信號可以作為一種重要的診斷信號。一旦生物體探針成為可能,將會成為鑒別特異核酸序列,進行非入侵診斷,獲取診斷圖像的一種有力輔助手段。

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