標籤:固氮

生物固氮是指固氮微生物將大氣中的氮氣還原成氨的過程。固氮生物都屬於個體微小的原核生物,所以,固氮生物又叫做固氮微生物。根據固氮微生物的固氮特點以及與植物的關係,可以將它們分為自生固氮微生物、共生固氮微生物和聯合固氮微生物三類。

1固氮形式

共生固氮
共生固氮微生物只有和植物互利共生時,才能固定空氣中的分子態氮,共生固氮微生物可以分為兩類:一類是與豆科植物互利共生的根瘤菌,以及與榿木屬、楊梅屬和沙棘屬等非豆科植物共生的弗蘭克氏放線菌;另一類是與紅萍(又叫做滿江紅)等水生蕨類植物或羅漢松等裸子植物共生的藍藻。由藍藻和某些真菌形成的地衣也屬於這一類。
微生物
生物固氮
在自然界中,有很多原核微生物,包括細菌和放線菌,它們可以在特定條件下把氮氣還原為氨,因而被稱為固氮微生物。固氮微生物的固氮過程完全是生物和微生物自發進行的,無須提供任何能源和設備,因而它減少了能源的消耗。由於全部固氮過程都是生物活動,無污染物排放,有利於保護生態環境。同時,由於減少和免除了化學氮素的投入,使農產品中硝酸和亞硝酸物質大幅度降低,提高了農產品的品質,減少致癌物質對人類的危害。
根瘤菌
根瘤菌(root nodule bacteria)是與豆科植物共生,形成根瘤並固定空氣中的氮氣供植物營養的一類桿狀細菌。這種共生體系具有很強的固氮能力。已知全世界豆科植物近兩萬種。根瘤菌是通過豆科植物根毛、側根杈口(如花生)或其他部
根瘤菌

  根瘤菌

位侵入,形成侵入線,進到根的皮層,刺激宿主皮層細胞分裂,形成根瘤,根瘤菌從侵入線進到根瘤細胞,繼續繁殖,根瘤中含有根瘤菌的細胞群構成含菌組織。

2氮循環

氮素在自然界中有多種存在形式,其中,數量最多的是大氣中的氮氣,總量約3.9×10^15 t。除了少數原核生物以外,其他所有的生物都不能直接利用氮氣。目前,陸地上生物體內儲存的有機氮的總量達1.1×10^10~1.4×10^10 t。這部分氮素的數量儘管不算多,但是能夠迅速地再循環,從而可以反覆地供植物吸收利用。存在於土壤中的有機氮總量約為3.0×10^11 t,這部分氮素可以逐年分解成無機態氮供植物吸收利用。海洋中的有機氮約為5.0×10^11 t,這部分氮素可以被海洋生物循環利用。
構成氮循環的主要環節是:生物體內有機氮的合成、氨化作用、硝化作用、反硝化作用和固氮作用。
植物吸收土壤中的銨鹽和硝酸鹽,進而將這些無機氮同化成植物體內的蛋白質等有機氮。動物直接或間接以植物為食物,將植物體內的有機氮同化成動物體內的有機氮。這一過程叫做生物體內有機氮的合成。動植物的遺體、排出物和殘落物中的有機氮被微生物分解后形成氨,這一過程叫做氨化作用。在有氧的條件下,土壤中的氨或銨鹽在硝化細菌的
氮循環

  氮循環

作用下最終氧化成硝酸鹽,這一過程叫做硝化作用。氨化作用和硝化作用產生的無機氮,都能被植物吸收利用。在氧氣不足的條件下,土壤中的硝酸鹽被反硝化細菌等多種微生物還原成亞硝酸鹽,並且進一步還原成分子態氮,分子態氮則返回到大氣中,這一過程叫做反硝化作用。
大氣中的分子態氮被還原成氨,這一過程叫做固氮作用。沒有固氮作用,大氣中的分子態氮就不能被植物吸收利用。地球上固氮作用的途徑有三種:生物固氮、工業固氮(用高溫、高壓和化學催化的方法,將氮轉化成氨)和高能固氮(如閃電等高空瞬間放電所產生的高能,可以使空氣中的氮與水中的氫結合,形成氨和硝酸,氨和硝酸則由雨水帶到地面)。據科學家估算,每年生物固氮的總量佔地球上固氮總量的90%左右,可見,生物固氮在地球的氮循環中具有十分重要的作用。

3分子氮

生物固氮是固氮微生物特有的一種生理功能,這種功能是在固氮酶的催化作用下進行的。固氮酶是一種能夠將分子氮還原成氨的酶。固氮酶是由兩種蛋白質組成的:一種含有鐵,叫做鐵蛋白,另一種含有鐵和鉬,叫做鉬鐵蛋白。只有鐵蛋白和鉬鐵蛋白同時存在,固氮酶才具有固氮的作用。生物固氮過程可以用下面的反應式概括表示。
N2 + 6H+ + nMg-ATP +6e-(酶)→2NH3+nMg-ADP+nPi
分析上面的反應式可以看出,分子氮的還原過程是在固氮酶的催化作用下進行的。有三點需要說明:第一,ATP一定要與鎂(Mg)結合,形成Mg-ATP複合物后才能起作用;第二,固氮酶具有底物多樣性的特點,除了能夠催化N2還原成NH3以外,還能催化乙炔還原成乙烯(固氮酶催化乙炔還原成乙烯的化學反應,常被科學家用來測定固氮酶的活性)等;第三,生物固氮過程中實際上還需要黃素氧還蛋白或鐵氧還蛋白參與,這兩種物質作為電子載體能夠起到傳遞電子的作用。
鐵蛋白與Mg-ATP結合以後,被黃素氧還蛋白或鐵氧還蛋白還原,並與鉬鐵蛋白暫時結合以傳遞電子。鐵蛋白每傳遞一個e-給鉬鐵蛋白, 同時伴隨有兩個Mg-ATP的水解。在這一催化反應中,鐵蛋白反覆氧化和還原,只有這樣,e-和H+才能依次通過鐵蛋白和鉬鐵蛋白,最終傳遞給N2和乙炔,使它們分別還原成NH3和乙烯。
1886年在第59屆德國科學家和醫生學術討論會上,德國學者赫爾利格爾(Hermann Hellriegel)首次提出令人驚奇的試驗結果,即當大豆生長在缺氮的土壤中時,大豆的根瘤也能使其良好生長,其機理在於其根瘤具有固氮功能。在當時稱之為根生桿菌,現在稱之為大豆根瘤菌的細菌對豆科植物根部的根瘤形成具有特殊的刺激作用。在根瘤菌內,根瘤菌將大氣中的氮還原為能被植物吸收利用的氨,豆科宿主在吸收了這些氨之後又能將其轉變為含氮有機化合物,以供其生長發育之需。通過對根瘤菌進行接種培養後於1895年就獲得了具有很強固氮能力的根瘤菌菌種。通過添加滅菌草木灰等吸附劑之後,大批根瘤菌被施用到三葉草、豌豆和小扁豆等豆科作物的種植地中以提高其產量。
現在已經知道,在自然界具有固氮功能的生物種類很多,其中有自養固氮生物和異養固氮生物這兩大類型。在異養固氮生物中因宿主植物的差異而被劃分為豆科植物共生固氮菌和非豆科植物共生固氮菌。儘管固氮生物多種多樣,但在其固氮過程中都需要共同的固氮基因(nif)的參與。在共生固氮生物中固氮體系非常複雜,除了nif基因在固氮過程中起關鍵性作用之外,其它基因的協同作用也非常重要。
由於根瘤菌具有的特殊功能,大批熱心的研究者對其特徵特性,對寄主的侵染方式、固氮機制和商業價值等進行了系統的研究。本世紀80年代以來,學者們一方面從分子水平進一步研究根瘤菌在豆科植物上的固氮機理和改造根瘤菌,試圖培育出活性更強的根瘤菌;另一方面利用人工誘導方式誘發非豆科作物根部結瘤,試圖利用根瘤菌的特殊功能使非豆科作物也能共生固氮,以便減少農田中氮肥的施用量,降低農作物的生產成本。除此之外,在70年代末,由於在放線菌中發現了弗蘭克氏菌(Frankia)與多種非豆科樹木能共生結瘤並具有固氮效應,因而在生物固氮研究中又產生了一個新的分支,即以研究弗蘭克氏菌的分類、功能、分佈和應用前景為主要內容的新領域。從現有的研究結果來看,與豆科植物的根瘤菌的固氮體系相比,利用弗蘭克氏菌具有廣譜侵染的特性,對建立新的固氮技術體系可能具有更大的意義,應用前景更廣闊。
非豆科
在非豆科植物生物固氮的研究中主要包括兩個研究方向。其一是採用適當的技術路線和切實可行的研究方法將根瘤菌導入非豆科作物中,在非豆科作物與根瘤菌之間形成共生關係,由此形成根瘤,擴大根瘤菌的宿主範圍和提高其固氮效應。其二是採用先進的生物技術進一步對固氮放線菌Frankia的生物學特性及其應用價值進行探討,以便挖掘Frankia菌在非豆科植物上的固氮潛力,由此形成生物固氮的新技術體系。
1.在非豆科植物與根瘤菌之間形成共生關係的探討
德國植物學家拜爾(1888)首次在半寄生性草本植物草山蘿和大豬鼻花(屬於非豆科植物)的根部發現了根瘤,但這一奇特的現象並沒有引起人們的關注。特里尼克(Trinick)(1973)首次證實,豇豆屬植物根系中所存在的根瘤菌能與榆科植物共生結瘤固氮。帕甘(Pagan)等(1975)在試驗中發現,在沒有宿主植物細胞的情況下,豇豆根瘤菌能在人工培養基上獨立生活和自行固氮,否定了長期以來一直認為根瘤脫離宿主植物就不能固氮的傳統觀念。如今已經知道,在殘留的根部形成根瘤的非豆科植物的數量並不少,僅在俄羅斯的西伯利亞就有75個物種,分屬於21個科,其中在進化史中最為年青的菊科植物中,其根系形成根瘤是一種最常見的現象。在新幾內亞,在榆科的狗兒屎屬植物Parasporiarogosa通常生長在茶葉樹的行間,在其根部很容易發現與熱帶豆科植物相類似的結瘤現象。
在自然條件下植物體與微生物相結合后形成固氮體系的現象在70年代就已經引起了人們的關注。除了根瘤菌與豆科植物之間的共生固氮關係之外,還存在著蘭綠藻與植物固氮;微生物與植物葉面結合固氮;土壤微生物與植物結合固氮;含脂剛螺菌與高等植物結合固氮。除此之外,對固氮稻的研究有了新的進展。在稻的根際嫌氣性細菌和好氣性細菌呈鑲嵌狀態,有著保護氧的作用,故稻的根際是最適於固氮菌存在的地方;現代栽培稻的固氮能力及各品種在固氮能力上所存在的差異是由其遺傳性所支配,旱稻幾乎沒有固氮能力;在稻根際與固氮菌之間存在著鬆弛的共生關係。有關專家預測,通過尋找稻根際固氮基因和支配其固氮能力的基因,有可能利用具有更強固氮能力的基因或基因組,通過基因工程培育出固氮稻新品系。在80年代中期,將含有固氮調控基因nifA的質粒pMC78A引進到水稻根際固氮菌——催娩克氏菌(klebsiellaoxytocaNG18)中之後,篩選到耐氨菌株。將耐氨固氮菌接種到水稻根系之後,其根際固氮活性提高3~5倍,植株含氮總量提高20~30%,植株乾重增加10~20%(日該國立遺傳學研究所,1985~1986)。
自從聶延富(1983)利用植物生長素2,4-D處理根系,誘導根瘤菌侵入小麥根部形成根瘤的試驗獲得成功之後,中國在利用根瘤菌侵染非豆科植物形成根瘤方面開展了多方面的探索性研究,試圖通過人工方法促使非豆科植物與根瘤菌形成共生關係,以便擴大生物固氮的範圍。目前關於利用2,4-D誘導非豆科作物根系與固氮菌共生結瘤,國內外已在小麥、油菜、水稻和胡蘿蔔等作物上取得了成功。阿勒馬拉(Al-Mallah)等(1989)利用纖維素酶yc、果膠酶Y23和甘露醇的細胞壁降解酶混合物處理幼苗根系,在有聚乙二醇存在的條件下將根瘤菌接種在水稻根繫上,結果,在水稻根繫上結出了根瘤。自80年代以來,中國相繼對水稻、玉米、小麥和高梁等非豆科作物的聯合結瘤固氮進行了深入的研究,成功地分離出一批具有高效固氮功能的聯合固氮菌株,如糞產鹼菌、稻黃桿菌和固氮螺菌等等。中國學者提出的「共生固氮體系中最佳結瘤固氮控制模型的研究」的探索性項目被列入國家的「攀登計劃」。然而,總的來看,作為基礎性研究,國內外在非豆科作物固氮方面雖不斷取得新進展,但離農業生產的實際應用還有相當長的一段距離。
2.引導固氮生物侵入非豆科植物的方法
豆科植物的根瘤是一個非常複雜的共生體系,根瘤菌與豆科植物根系的相互結合依賴於特異的遺傳機制。為了打破根瘤菌與豆科植物根系共生結瘤固氮的特異性,將豆科植物的共生固氮特性擴大到不具有共生固氮特性的非豆科植物中,研究者們從許多途徑進行了有益的嘗試,獲得了一些有效方法,其中包括如下6種常用的方法。
第一,利用改造后的豆科植物根瘤菌直接侵染非豆科植物。利用基因工程技術構建攜帶有特定結瘤基因的質粒,然後將其轉入到適當的根瘤菌中,由此獲得發生質粒重組的受體菌,再利用受體菌直接侵染非豆科植物。
第二,利用植物裸露的原生質體吸收固氮微生物,以此建立起新的固氮體系。已經證實,裸露的原生質體比較容易吸收外源遺傳物質,不但豆科植物的原生質體具有吸收固氮微生物的功能,而且非豆科植物的原生質體也具有吸收固氮微生物的功能。曾經利用玉米的原生質體吸收棕色固氮菌后,玉米原生質體表現出固氮活性,這樣的原生質體可以培養成愈傷組織,由此分化出的胚在完全缺氮源的培養基上能夠進一步生長發育。
第三,通過植物愈傷組織與固氮微生物進行聯合培養,建立新的共生固氮體系。將豆科根瘤菌分別放入半支蓮、胡蘿蔔、矮牽牛和囊龍面花等非豆科植物的愈傷組織中,經過聯合培養后根瘤菌與愈傷組織形成新的共生關係,表現出固氮活性。
第四,利用酶處理打破根瘤菌侵染根毛的障礙。已知根瘤菌對宿主根毛區的侵染表現出很強的專一性,即特定的根瘤菌侵染特定的宿主。在玉米、水稻和小麥等作物上的試驗結果表明,利用纖維素酶和果膠酶處理作物的根部后,其根毛細胞的細胞壁會發生局部破壞,這有助於根瘤菌的侵染和共生結瘤。
第五,利用植物激素打破根瘤菌侵染根毛的障礙。通過對非豆科植物的根系進行2,4-D處理后可以誘導豆科根瘤菌侵入其根皮層細胞內,隨後可以形成根瘤菌。然而,更進一步的研究結果表明,在2,4-D誘導下在非豆科植物根系內所形成的根瘤與豆科植物的有效根瘤在結構上和功能上都存在著明顯差異,其機理還有待於進一步研究。
第六,通過豆科植物與非豆科植物的原生質體融合后培育出新的固氮植物。在70年代中期將窄葉羽扇豆類菌體的原生質體與煙草葉肉原生質體融合成功后,獲得了融合體。然而,目前在這方面的研究還有一些技術問題亟待解決。
3.在非豆科植物與Frankia菌之間形成共生關係的探討
佩克洛(Peklo)(1910)首次提出從非豆科樹木的根瘤中分離內生菌的設想,但他一直沒有達到預期目的。在本世紀60年代,通過超顯微觀察后證實,在非豆科樹木根瘤內所存在的固氮菌是原核生物,其絲狀體有分枝。貝金(Becking)(1970)將非豆科樹木根瘤內所存在的內生菌歸屬於原核生物界,厚壁菌門,放線菌綱,放線菌目,弗蘭克氏菌科,弗蘭克氏菌屬。直到70年代末,卡拉哈姆(Callaham)等(1978)在香蕨木植物的根系中找到了共生根瘤並從共生根瘤中首次分離出內生放線菌。已經證實,在木麻黃、榿木、胡頹子、沙棘、楊梅、馬桑、懸鉤子、仙女木和赤楊等非豆科根瘤中所存在的內生固氮菌屬於弗蘭克氏(Frankia)菌屬的微生物。近年的研究主要集中在對該菌的特徵特性進行研究。由此發現,Frankia菌宿主範圍比較寬,在非豆科樹木的一些科、屬、種間不僅存在交叉感染現象,而且由同一種樹木的根瘤內可以獲得在特徵特性上存在著明顯不同的Frankia菌株。Frankia菌是生長緩慢型微好氣性放線菌,能形成特徵性孢子囊,在孢子囊內含有通過縱橫分裂所形成的不遊動孢囊孢子。
在被子植物中能與Ftsnkia菌共生結瘤固氮的非豆科植物皆為喬木或灌木等木本植物,它們不僅具有強大的固氮能力,而且,通常還具有耐乾旱(如沙棘)、耐鹽鹼(如木麻黃)、耐酸性(如楊梅)和耐水濕(如赤楊)等特性。據阿克曼(Akkermans)等人(1984)統計,已經發現21屬200種非豆科植物能與Frankia菌共生結瘤固氮。隨後,黃家彬等(1985)在中國又發現20種新記載樹種具有與Frankia菌共生結瘤固氮的特性。最近,李志真等(1998)在福建省林區內發現5種能與Frankia菌共生結瘤固氮的非豆科樹種。因此,目前已發現8科25屬225種非豆科植物能與Frankia菌共生結瘤固氮。
中國於70年代末期開始研究放線菌結瘤植物,在資源調查、內生菌分離和Frankia菌的生物學特徵特性等方面做了大量的研究工作。目前中國已經成為國際上擁有Frankia菌株資源最多的基地之一。除此之外,在利用細胞融合技術改進Frankia菌的特徵特性方面已有新的苗頭,利用鏈黴菌和Frankia菌融合后已經成功地構建成新型的共生固氮放線菌,它具有雙親本性能,即生長快、結瘤固氮活性強。
Frankia菌具有跨越科、屬植物進行侵染結瘤固氮的特性,因而被認為是研究擴大寄主範圍、結瘤機制、固氮基因轉移和構建新的固氮物種的理想材料。隨著對Frankia菌的特徵特性的不斷認識,人們試圖將此共生體系的固氮功能由木本植物轉到禾本科作物上,以解決農田氮肥自給問題,減少農作物對氮素化肥的依賴。隨著研究的不斷深入,人類將進一步揭示Frankia菌共生固氮的奧秘,闡明其遺傳機制。利用生物工程技術和方法構建高效的Frankia工程菌和構建新的固氮共生體系將成為今後生物固氮研究領域中的發展方向和追求目標。
簡介
生物固氮在農業生產中具有十分重要的作用。氮素是農作物從土壤中吸收的一種大量元素,土壤每年因此要失去大量的氮素。如果土壤每年得不到足夠的氮素以彌補損失,土壤的含氮量就會下降。土壤可以通過兩條途徑獲得氮素:一條是含氮肥料(包括氮素化肥和各種農家肥料)的施用;另一條是生物固氮。科學家在20世紀80年代推算過,全世界每年施用的氮素化肥中的氮素大約有8*10^7t,而自然界每年通過生物固氮所提供的氮素,則高達4*10^8t。
做綠肥
用豆科植物做綠肥,例如將田箐、苜蓿或紫雲英等的新鮮植物直接耕埋或堆漚后施用到農田中,可以明顯增加土壤中氮的含量。科學家統計過,一般地說,1hm^2農田使用7500kg綠肥,可以增產糧食750kg。如果用新鮮的豆科植物飼養家畜,再將家畜的糞便還田,則既可以使土壤肥沃,又可以獲得更多的糧食和畜產品。
本世紀初以來全球農作物單位面積產量不斷增長,在一定程度上依賴於氮素化肥的施用量不斷增加。農作物依賴於施用氮素化肥所獲得的增產實際上是以消耗能源和污染環境為代價所取得的。在大氣中氮氣含量接近80%,但這種氮氣並不能直接為高等植物吸收利用。人類自從發現豆科植物與根瘤菌共生結瘤固氮現象以來對生物固氮研究已有112年之久,中國對生物的共生固氮現象也進行了長達62年的探索性研究。然而,關於生物固氮,特別是非豆科農作物的生物固氮,還有許多問題有待於進一步研究。目前,生物固氮研究已經被列為「國際生物學計劃」中的重點研究內容,各國政府都將其視為重點科技攻關項目。通過適當方式將生物固氮機制引入到非豆科農作物中,進而建立起非豆科農作物固氮新體系,這是農業科學研究中一項富有挑戰性的研究課題。這不僅引起了農業科學家的極大興趣,而且也受到了全社會各階層有識之士的廣泛關注。

4意義

大氣中的氮,必須通過以生物固氮為主的固氮作用,才能被植物吸收利用。動物直接或間接地以植物為食物。動物體內的一部分蛋白質在分解過程中產生的尿素等含氮廢物,以及動植物遺體中的含氮物質,被土壤中的微生物分解后形成氨,氨經過土壤中的硝化細菌的作用,最終轉化成硝酸鹽,硝酸鹽可以被植物吸收利用。在氧氣不足的情況下,土壤中的另一些細菌可以將硝酸鹽轉化成亞硝酸鹽並最終轉化成氮氣,氮氣則返回到大氣中。除了生物固氮以外,生產氮素化肥的工廠以及閃電等也可以固氮,但是,同生物固氮相比,它們所固定的氮素數量很少。可見,生物固氮在自然界氮循環中具有十分重要的作用。
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