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甲基化酶,原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統中的一員,用於保護宿主DNA不被相應的限制酶所切割。在E.coli中,大多數都有三個位點特異性的DNA甲基化酶。

1 甲基化酶 -簡介

甲基化酶  一、甲基化酶的種類
  原核生物甲基化酶是作為限制與修飾系統中的一員,用於保護宿主DNA不被相應的限制酶所切割。在E.coli中,大多數都有三個位點特異性的DNA甲基化酶。
  1.Dam甲基化酶
  Dam甲基化酶可在GATC序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基。一些限制酶(PvuⅡ,BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、XhoⅡ、MboⅠ、Sau3AⅠ)的識別位點中含GATC序列,另一些酶ClaⅠ(1/4)、XbaⅠ(1/16)、TaqⅠ(1/16)、MboⅠ(1/16)、HphⅠ(1/16)的部分識別序列含此序列,如平均4個ClaⅠ位點(ATCGATN)中就有一個該序列。
  有些限制酶對Dam甲基化的DNA敏感,不能切割相應的序列,如BclⅠ、ClaⅠ、XbaⅠ等。對甲基化不敏感的有BamHⅠ、Sau3AⅠ、BglⅡ、PvuⅠ等。MboⅠ和Sau3AⅠ識別和切割位點相同,但其差異就在於前者對甲基化敏感。
  一般哺乳動物DNA不會在腺嘌呤N6上甲基化,因此對甲基化敏感的限制酶切割這些DNA不會受到影響。當需要在這些敏感位點上完全切割DNA時,可利用dam-E.coli擴增並提取DNA。
  2.Dcm甲基化酶
  Dcm甲基化酶識別CCAGG或CCTGG序列,在第二個胞嘧啶C的C5位置上引入甲基。受Dcm甲基化作用影響的酶有EcoRⅡ(↓CCWGG)。大多數情況下,其同裂酶BstNⅠ(CC↓WGG)可避免這一影響,因為二者識別序列雖然相同,但切點不同。
  受此甲基化酶影響的酶還有Acc65Ⅰ、AlwNⅠ、ApaⅠ、EcoRⅡ和EaeⅠ等。不受此甲基化影響酶有BanⅡ、Bg1Ⅰ、BstNⅠ、KpnⅠ和NarⅠ等。
  3.EcoKⅠ甲基化酶
  EcoKⅠ甲基化酶的識別位點少,識別AAC(N)6GTGC和GCAC(N)6GTT序列中A的N6位置。但因為識別位點少(1/8kb),所以研究較少。
  4.SssⅠ甲基化酶

  SssⅠ甲基化酶來自原核生物Spiroplasma,可使CG序列中的C在C5位置上甲基化。甲基化的模板可以是甲基化或半甲基化鏈(新合成鏈)的DNA鏈。SssⅠ甲基化的DNA受E.coli中mcrA、mcrBC、MRR系統的限制。許多酶對此甲基化敏感,如AatⅡ、ClaⅠ、XhoⅠ、SalⅠ等,也有不敏感的,如BamHⅠ、EcoRⅠ、SphⅠ和KpnⅠ。
  二、依賴於甲基化的限制系統
  E.coli中至少有3種依賴於甲基化的限制系統mcrA、mcrBC和mrr,它們識別的序列各不相同,但只識別經過甲基化的序列,都限制由CpG甲基化酶(MSssⅠ)作用的DNA(限制即消化降解)。Mrr限制m6A;McrA限制HpaⅡ甲基化修飾的位點;McrBC切割兩套半位點(G/A)mC,這兩套位點之間間隔2kb,最適為55~103bp,需GTP;大多數常用的E.coli都含這三個限制系統中的一個或幾個,三個都不限制Dcm修飾的位點,Mrr不限制dam、EcoKⅠ、EcoRⅠ修飾的位點。
  三、甲基化對限制酶切的影響
  1.修飾酶切位點
  HincⅡ可識別四個位點(GTCGAC、GTCAAC、GTTGAC和GTTAAC),甲基化酶M.TaqⅠ可甲基化TCGA中的A,所以M.TaqⅠ處理DNA后,GTCGAC將不受HincⅡ切割。
  M.MspⅠ修飾的產物為m5CCGG,在BamHⅠ識別位點(GGATCC)前面如果為CC或後面為GG,那麼經M.MspⅠ處理的DNA(GGATm5CCGG)對BamHⅠ不敏感(即抵抗切割)。
  構建DNA文庫時,用AluⅠ(AG↓CT)和HaeⅢ(GG↓CC)部分消化基因組DNA后,將得到的片段用M.EcoRⅠ甲基化酶處理,然後加上合成的EcoRⅠ接頭,再用EcoRⅠ來切割時只有接頭上的位點可被切割,從而保護基因組片段。
  2.產生新的酶切位點
  通過甲基化修飾可產生新的酶切位點。DpnⅠ是依賴甲基化的限制酶,TCGATCGA受M.TaqⅠ處理后形成甲基化(A)產物TCG*ATCG*A,其中G*ATC即為DpnⅠ位點。
  3.對基因組作圖的影響
  在研究哺乳動物m5CG、植物m5CG和m5CNG、腸道細胞Gm6ATC的甲基化水平和分佈時,利用限制酶對甲基化的敏感性差異,大有作為。

目的調查國內6個省市25家醫院臨床分離鮑曼不動桿菌中介導高水平氨基糖苷類抗生素耐葯的16SrRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB的分佈情況。方法收集2004年12月-2005年12月國內6省市8家省級醫院、浙江省11個地區17家市級醫院臨床分離的700株鮑曼不動桿菌。瓊脂稀釋法測定其對妥布黴素、阿米卡星、慶大黴素、異帕米星、奈替米星5種氨基糖苷類抗生素的最低抑菌濃度(MIC)值;PCR篩選三種甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB,克隆測序明確基因型;脈衝場凝膠電泳(PFGE)分析菌株的同源性;質粒抽提、接合試驗及Southern雜交確定armA基因定位。結果對阿米卡星、慶大黴素、異帕米星、奈替米星的耐葯率分別為67.7%、70.9%、75.7%、63.5%和71.5%。對5種氨基糖苷類抗生素全部耐葯的菌株有377株,其中334株檢出armA基因;未發現rmtA、rmtB陽性菌株。armA基因陽性菌株PFGE分型以A、B、C為主。鹼裂解法反覆抽提未得到質粒,多次接合試驗未成功;Southern雜交顯示,armA基因分別位於克隆A、B、c菌株染色體ApaⅠ酶切PFGE約220、300、220kb大小的PFGE片段上。結論16SrRNA甲基化酶基因armA在鮑曼不動桿菌中廣泛存在,armA基因位於鮑曼不動桿菌的染色體上。

2 甲基化酶 -參考資料

http://baike.baidu.com/view/1741082.htm
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