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1定義

一、目的基因的定義:把需要研究的基因稱為目的基因。(一般把需要分析的基因稱靶基因,在基因克隆過程中有時兩者均稱為插入基因,有時三者含義相近。)

2目的基因的製備

(二)染色體DNA的限制性內切酶酶解
II型限制性內切酶可專一性地識別並切割特定的DNA順序,產生不同類型的DNA末端。若載體DNA與插入的DNA片段用同一種內切酶消化,或靶DNA與載體DNA末端具有互補的粘性末端,可以直接進行連接。
DNA分子經限制酶切割產生的DNA片段末端通常有兩種形式——黏性末端和平末端。當限制酶在識別序列的中心軸線兩側將DNA的兩條鏈分別切開時,產生的是黏性末端,而當限制酶在它識別序列的中心軸線處切開時,產生的則是平末端。
(四)用逆轉錄酶製備cDNA
大多數的目的基因是由mRNA合成cDNA(反轉錄DNA)得到。從RNA入手,先從細胞提取總RNA,然後根據大多數真核mRNA含有多聚腺嘌呤(polyadenylic acid ,polyA)尾的特點,用寡聚dT纖維素柱將mRNA分離出,以mRNA為模板,在多聚A尾上結合12-18個dT的寡聚dT片段,作為合適的起始引物,在逆轉錄酶作用下合成第一條。
(六)PCR技術擴增

3基因的製備流程

cDNA鏈。用鹼或RNA酶水解除去mRNA,再用DNA聚合酶,最好是Klenow片段合成第二條DNA鏈。雙鏈合成后,用S1核酸酶切去髮夾結構,即可獲得雙鏈cDNA。cDNA用於探針製備、序列分析、基因表達等研究。因此以cDNA為研究材料,反映了mRNA的轉錄及對以後翻譯的影響情況,即反映某一基因(DNA)外顯子的情況。

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