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相差顯微鏡(phasecontrast microscope)由P.Zernike於1932年發明,並因此獲1953年諾貝爾物理獎。這種顯微鏡最大的特點是可以觀察未經染色的標本和活細胞。相差顯微鏡的基本原理是,把透過標本的可見光的光程差變成振幅差,從而提高了各種結構間的對比度,使各種結構變得清晰可見。光線透過標本后發生折射,偏離了原來的光路,同時被延遲了1/4λ(波長),如果再增加或減少1/4λ,則光程差變為1/2λ,兩束光合軸后干涉加強,振幅增大或減下,提高反差.

1 相差顯微鏡 -簡介

相差顯微鏡相差顯微鏡

相差顯微鏡(Phase contrast microscope)是荷蘭科學家Zermike於1935年發明的,並因此獲1953年諾貝爾物理獎,用於觀察未染色標本的顯微鏡。活細胞和未染色的生物標本,因細胞各部細微結構的折射率和厚度的不同,光波通過時,波長和振幅並不發生變化,僅相位發生變化(振幅差),這種振幅差人眼無法觀察。而相差顯微鏡通過改變這種相位差,並利用光的衍射和干涉現象,把相差變為振幅差來觀察活細胞和未染色的標本。相差顯微鏡和普通顯微鏡的區別是:用環狀光闌代替可變光闌,用帶相板的物鏡代替普通物鏡,並帶有一個合軸用的望遠鏡。

2 相差顯微鏡 -功能

相差顯微鏡具有兩個其他顯微鏡所不具有的功能:①將直射的光(視野中背景光)與經物體衍射的光分開;②將大約一半的波長從相位中除去,使之不能發生相互作用,從而引起強度的變化。


3 相差顯微鏡 -相差顯微鏡的基本原理

利用物體不同結構成分之間的折射率和厚度的差別,把通過物體不同部分的光程差轉變為振幅(光強度)的差別,經過帶有環狀光闌的聚光鏡和帶有相位片的相差物鏡實現觀測的顯微鏡。主要用於觀察活細胞或不染色的組織切片,有時也可用於觀察缺少反差的染色樣品。   

把透過標本的可見光的光程差變成振幅差,從而提高了各種結構間的對比度,使各種結構變得清晰可見。光線透過標本后發生折射,偏離了原來的光路,同時被延遲了1/4λ(波長),如果再增加或減少1/4λ,則光程差變為1/2λ,兩束光合軸后干涉加強,振幅增大或減下,提高反差。

4 相差顯微鏡 -相差顯微鏡使用中的幾個問題

(1)相位倒轉 當n』n時得到象的明暗反差正好相反,稱為相位倒轉。當相位差δ=0時是無法識別的,隨著δ的增大反差變大,當δ繼續增大到某一值後會出現相位倒轉。用90%高吸光值(高反差)物鏡時,這個轉變值約為0.55λ,用70%標準吸光值的物鏡時約為0.33λ。較高吸光值的物鏡應該用於分辨較小的光程差。   
(2)暈輪和漸暗效應 在相差顯微鏡成象過程中,某一結構由於相位的延遲而變暗時,並不是光的損失,而是光在象平面上重新分配的結果。因此在黑暗區域明顯消失的光會在較暗物體的周圍出現一個明亮的暈輪。這是相差顯微鏡的缺點,它妨礙了精細結構的觀察,當環狀光闌很窄時暈輪現象更為嚴重。相差顯微鏡的另一個現象是漸暗效應,指相差觀察相位延遲相同的較大區域時,該區域邊緣會出現反差下降。   
(3)樣品厚度的影響 當進行相差觀察時,樣品的厚度應該為5μm或者更薄,當採用較厚的樣品時,樣品的上層是很清楚的,深層則會模糊不清並且會產生相位移干擾及光的散射干擾。   
(4)蓋玻片和載玻片的影響 樣品一定要蓋上蓋上蓋玻片,否則環狀光闌的亮環和相板的暗環很難重合。相差觀察對載玻片和蓋玻片的玻璃質量也有較高的要求,當有划痕,厚薄不均或凹凸不平時會產生亮環歪斜及相位干擾。另外玻片過厚或過薄時會使環狀光闌亮環變大或變小。

5 相差顯微鏡 -特殊構造

相差顯微鏡照明原理 

在構造上,相差顯微鏡有不同於普通光學顯微鏡2個特殊之處:    

1.環形光闌(annular  diaphragm) 位於光源與聚光器之間,作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐,焦聚到標本上。

    2.相位板(annular phaseplate)在物鏡中加了塗有氟化鎂的相位板,可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種:

    (1)A+相板:將直射光推遲1/4λ,兩組光波合軸后光波相加,振幅加大,標本結構比周圍介質更加變亮,形成亮反差(或稱負反差)。

    (2)B+相板:將衍射光推遲1/4λ,兩組光線合軸后光波相減,振幅變小,形成暗反差(或稱正反差),結構比周圍介質更加變暗。

    3.合軸調節望遠鏡:用於調節環狀光闌的像與相板共軛面完全吻合。

4.綠色濾光片:縮小照明光線波長範圍,減少由於照明光線的波長不同引起的相位變化。

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