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管碟法抗生素效價測量

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管碟法抗生素效價測量是以抗生素對微生物的抗菌效力作為效價的衡量標準,具有與應用原理相一致、用量少和靈敏度高等優點。

1 管碟法抗生素效價測量 -簡介

抗生素的生物檢定是以抗生素對微生物的抗菌效力作為效價的衡量標準,具有與應用原理相一致、用量少和靈敏度高等優點。管碟法是瓊脂擴散法中的一種,已被各國藥典廣泛採用,作為法定的抗生素生物檢定方法。

2 管碟法抗生素效價測量 -原理


當抗生素在菌層培養基中擴散時,會形成抗生素濃度由高到低的自然梯度,即擴散中心濃度高而邊緣濃度低。因此,當抗生素濃度達到或高於MIC(最低抑制濃度)時,試驗菌就被抑制而不能繁殖,從而呈現透明的抑菌圈。根據擴散定律的推導,抗生素總量的對數值與抑菌圈直徑的平方成線性關係。北京潮聲公司具有同行業的領先水平。

在管碟法抗生素效價測量實驗中需要注意的影響因素分析及對策如下:

管碟法是國內外常用的抗生素微生物檢定法【1】,利用管碟法測定抗生素效價,具有準確、直觀、重複性好等優點,因而被廣泛採用。但是整個試驗過程中影響結果的因素很多,任何一個環節操作不當或者忽略就會造成很大誤差,導致整組試驗失敗。根據實際操作中的積累經驗,對管碟法中影響試驗結果的因素進行如下分析及提出解決的方法。

3 管碟法抗生素效價測量 -實驗

 

1. 實驗器材的準備

1.1 實驗器材的選擇

試驗應該選擇底面平整的玻璃雙碟,避免底面的凹凸影響瓊脂層的厚度。可將雙碟放置在水平台上,下墊一層白紙,加入3mL水,再滴加藍墨水,根據藍色是否深淺一致來判斷雙碟底面平整程度。小鋼管則應該選擇加工精細的同一批產品,這樣才能保證管壁厚薄與重量均勻一致,使得小鋼管在培養基中下陷相同的深度,抗生素溶液擴散均勻有可比性。如果小鋼管兩端不夠平,就應予剔除,否則會使抗生素溶液漏出,破壞均勻擴散現象。

1.2 實驗器材的清洗

抗生素試驗中,玻璃雙碟、小鋼管往往會連續使用。由於清洗方面的原因,它們還是容易殘留上次試驗中的抗生素(慶大黴素、爭光黴素、鏈黴素等)或者被清洗用的殺菌劑(如新潔而滅、洗潔精、去污粉等)污染,以至於在下次試驗中造成抑菌圈不正常的現象。因此,在清洗時要尤為注意多用流水沖洗。160℃乾熱滅菌2h後備用。

2. 配製試驗所需的樣品、標準品、緩衝液與培養基
2.1 樣品與標準品溶液的配製

標準品與樣品從冰箱取出后,使與室溫平衡。供試品應放於乾燥器內至少30min方可稱取。稱量最好為一次取樣稱量,動作迅速,不得反覆稱取,取樣后立即將稱量瓶瓶蓋蓋好,以免吸水。標準品的稱量最好用1/100,000克的分析天平,樣品稱量不得低於1/10,000克的分析天平。天平中的乾燥劑應保持經常注意更換。稱量結束后,加入超聲波處理后的磷酸緩衝液,定容至刻度,過濾並稀釋。稀釋時,都應採用容量瓶,每一步稀釋取樣量不得少於2mL。用刻度吸管吸取溶液前,要用待稀釋液沖洗吸管2~3次,吸取溶液后,要用濾紙把刻度吸管外壁多餘液體擦去,再從起始刻度開始放溶液。把稀釋后的抗生素溶液分裝至乾燥滅菌試管待用。在稱量抗生素樣品過程中,操作者的工作服上有可能會沾染抗生素粉末,在配培養基、加底層培養基、加菌層培養基或滴加抗生素溶液時,會隨衣袖的抖動落入培養基,造成破圈或者無抑菌圈。所以配製抗生素溶液應單獨使用一套工作服。

2.2 培養基與緩衝液的配製

配製培養基與緩衝液時要按照文獻的配比用量,配製后調節其pH值。因為在pH值、鹽濃度的影響下,即使瓊脂培養基上的兩個相鄰的小管距離足夠,還是可能會出現卵圓形抑菌圈。例如四環素易受pH值影響,鏈黴素易受鹽濃度影響【2】。培養基可以購買廠家生產的產品,因為大批量產品中的成分配比較穩定,可比性較強。116℃濕熱滅菌20min後備用。

3. 加註培養基

3.1 加註底層培養基

無菌室工作檯面可能因為使用時間已久,變得凹凸不平或者傾斜,會影響培養基菌層的厚度均勻性。菌層越薄,形成的抑菌圈越大,會給試驗造成很大的誤差。我們可以在桌面上放置一塊足夠大的玻璃平板,保證雙碟放置區域的平整。在雙碟底部預先標記樣品的高低濃度區域,在加註培養基底層的時候,有順序地按照一致方向排列。接下來加註培養基菌層的時候,仍然按照原來的位置與方向排列。這樣,即使桌面不夠水平,還是能夠保證培養基菌層是在水平的培養基底層上鋪開,達到消除誤差的目的。

試驗中加註的培養基如果溫度太低,就容易在內部結塊,或者加註到雙碟之後不能及時鋪開,使得培養基表面為非水平面,會給試驗帶來誤差。加註60~80℃的培養基底層之後,不應立即給雙碟加蓋。因為溫度過高的培養基會形成大量的水蒸氣,在雙碟蓋上凝集並滴落在已經凝固定的培養基底層上,會給培養基菌層的加註帶來影響。

3.2 加註培養基菌層

製備瓊脂培養基菌層時,培養基溫度過高或者受熱時間太長都會導致試驗菌死亡。當菌種為非芽孢桿菌的時候,現象尤為明顯,甚至會出現無菌生長。因此,培養基應放在50℃水浴中保溫。當加入試驗菌種混勻后,應儘快加註到底層培養基上。在試驗的時候,如果從大瓶內用刻度吸管吸取帶菌培養基,吸管中培養基量少極易冷卻,加在底層培養基上就不易均勻鋪開,導致菌層厚度不均,影響到抑菌圈的直徑。因此可以事先把配製好的培養基分裝在具塞試管內,每管5mL,濕熱滅菌後放在50℃水浴鍋內保溫。試驗中,再分別加入菌液混勻,配製成帶菌瓊脂。震蕩混勻後繼續保溫5min使培養基溫度回升,然後直接倒在底層培養基上,轉動雙碟使培養基均勻鋪開。

4. 放置小鋼管

放置小鋼管時,注意管與管之間不能太靠近,否則會引起相鄰的兩個抑菌圈之間的抗生素擴散區中的濃度增大,相互影響形成卵圓形或橢圓形抑菌圈。管與雙碟邊緣同樣也不能太靠近,因為液面浸潤作用,邊緣的瓊脂培養基菌層為非平面,會影響抑菌圈的形狀。可在試驗前在雙碟的底上用尺測量,作好標記,試驗中可以按照雙碟底面標記放置小鋼管,避免放置位置不恰當產生的問題。小鋼管放置時,要小心地從同一高度垂直放在菌層培養基上,不得下陷,不得傾斜,不能用懸空往下掉的方法。放置之後,不能隨意移動,要靜置5min,使之在瓊脂內稍下沉降穩定后,再開始滴加抗生素溶液。

5. 滴加抗生素溶液

滴加抗生素要按照SH→TH→SL→TL(二劑量法)或者SH→TH→SM→TM→SL→TL(三劑量法)的順序滴加【3】。滴加之前,滴管至少要用被滴液體沖洗3次。在滴加抗生素到小鋼管的時候,由於毛細管內抗生素溶液往往會有氣泡或者毛細管開口端有液體殘留,繼續滴加容易造成氣泡膨脹破裂,使溶液濺落在瓊脂培養基表面造成破圈。因此一旦毛細管中出現氣泡或者殘留,就重新吸取抗生素溶液進行滴加,毛細管口應避免太細,滴加的時候離開小鋼管口距離不要太高。滴加中若有濺出,可用濾紙片輕輕吸去,不致造成破圈。在滴加中還有可能出現抗生素溶液滴入小鋼管后,沒有與瓊脂培養基菌層接觸,有一段空氣被壓在溶液與培養基之間,這樣是不會產生抑菌圈的。此時可以小心的用滴管吸出小鋼管內的抗生素溶液,棄去。換滴管重新滴加。抗生素溶液滴加后,液面應該與小鋼管管口齊平,液面反光呈黑色。(抗生素液體加入量不能按滴計算,即使同一滴管,每滴的量也有差異。)如果抗生素溶液滴加過滿,可以用無菌濾紙片小心吸去多餘部分。

6. 雙碟中菌株的培養

滴加了抗生素溶液后的雙碟忌震動,要輕拿輕放。在搬運到培養箱的過程中,可以預先在培養箱中墊上報紙鋪平,再把雙碟連同墊於桌上的玻璃板小心運至培養箱,緩慢推入箱內。雙碟在37℃下培養約16h。時間太短會造成抑菌圈模糊,太長則會使菌株對抗生素的敏感性下降,在抑菌圈邊緣的菌繼續生長,使得抑菌圈變小。在培養過程中,如果溫度不均勻(過於接近熱源),會造成同一雙碟上細菌生長速率不等,使抑菌圈變小或者不圓。所以把雙碟放入培養箱時,要與箱壁保持一定的距離,雙碟疊放也不能超過3個。培養中,箱門不得隨意開啟,以免影響溫度。應經常注意溫度,防止意外過冷過熱。

7. 抑菌圈測量

7.1 試驗結果中抑菌圈直徑不應該過大或者過小,在試驗之前,可以先做一個關於用不同濃度菌液配製的瓊脂培養基菌層預試驗,選擇抑菌圈直徑在18~22mm的菌液濃度為試驗用濃度(菌液濃度約為106個/mL)。批量試驗中後期,菌液保存的時間過久,菌株就會逐漸衰亡,生長周期不一致,影響其對抗生素的敏感度,導致抑菌圈變大、模糊或者出現雙圈。如若菌株不純,也會造成這樣的結果。因此,菌液在使用一段時間后,可以重新配製純化或者減小原來菌液在使用中的稀釋倍數。

7.2 用遊標卡尺測量抑菌圈直徑,可以在雙碟底部墊一張黑紙,在燈光下測量。不宜取去小鋼管再測量,因為小鋼管中殘餘的抗生素溶液會流出擴散,使抑菌圈變得模糊。不能把雙碟翻轉過來測量抑菌圈直徑,因為底面玻璃折射會影響抑菌圈測量的準確度。記錄測量結果後進行效價計算。

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