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簡併序列在分子生物學研究中,基因克隆和分子雜交的探針製備等操作常需分離與已知RNA序列鄰近的未知序列,TAIL-PCR又叫熱不對稱交錯PCR,能夠較好地解決上述難題。該技術通過3個嵌套的特異性引物分別和簡併引物組合進行連續的PCR循環,利用不同的退火溫度選擇性地擴增目標片段,所獲得的片段可以直接用做探針標記和測序模板。

TAIL-PCR技術簡單易行,反應高效靈敏,產物的特異性高,重複性好,能夠在較短的時間內獲得目標片段,已經成為分子生物學研究中的一種實用技術。經改良過的TAIL-PCR成功地從突變體中克隆到外源插入基因的旁側序列,從而為啟動子的克隆提供了有效的新方法。

在利用特異引物和隨機引物進行PCR中一般有3種產物生成:
①由特異性引物和簡併引物擴增出的產物;
②由同一特異性引物擴增出的產物;
③由同一簡併引物擴增出的產物。
在TAIL-PCR反應中,其中后2種目標產物可以通過以嵌套的特異性引物進行的後續反應來消除。TAIL-PCR的基本原理是利用目標序列旁的已知序列設計3個嵌套的特異性引物(specialprimer,簡稱sp1,sp2,sp3,約20bp),用它們分別和1個具有低Tm值的短的隨機簡併引物(arbitrarydegenerateprime,AD,約14bp)相組合,以基因組RMA為模板,根據引物的長短和特異性的差異設計不對稱的溫度循環,通過分級反應來擴增特異引物。TAIL-PCR共分3次反應。

第一次反應包括5次高特異性、1次低特異、10次較低特異性反應和12個熱不對稱的超級循環。5次高特異性反應,使sp1與已知的序列退火併延伸,增加了目標序列的濃度;1次低特異性的反應使簡併引物結合到較多的目標序列上;10次較低特異性反應使2種引物均與模板退火,隨後進行12次超級循環。經上述反應得到了不同濃度的3種類型產物:特異性產物①型和非特異性產物(②型和③型)。

第二次反應則將第一級反應的產物稀釋1000倍作為模板,通過10次熱不對稱的超級循環,使特異性產物被選擇地擴增,而非特異產物含量極低。第三次反應又將第二次反應的產物稀釋作模板,再設置普通的PCR反應或熱不對稱超級循環,通過上述3次PCR反應可獲得與已知序列鄰近的目標序列。

1 簡併序列 -相關詞條

順式作用元件基因領域效應分子遺傳學
外顯子松果腺分子雜交


 

2 簡併序列 -參考鏈接

1、http://www.helixnet.cn/archiver/tid-2721.html
2、http://scitech.people.com.cn/GB/other2137/
3、http://book.sina.com.cn/nzt/spi/gongzuodna/

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