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紅細胞凝集試驗

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  指紅細胞凝集的現象。有由病毒、細胞凝集素和抗體而引起的紅細胞凝集。(1)由病毒而引起的凝集:G.H.Hirst(1941)發現流感病毒能使雞的紅細胞發生凝集,其後又發現其它各種病毒也能引起同樣的紅細胞凝集反應。即紅細胞表面存在著對各種病毒的受體,病毒與受體結合,以紅細胞為橋樑的結果而引起凝集。利用此反應可以進行病毒的定性和定量。另外,如果存在抗病毒的抗體時,則由病毒引起的凝集作用將被抑制,所以可用於抗病毒抗體的檢出。(2)由抗體引起的凝集:(a)如果存在對紅細胞表面決定基的抗體,則紅細胞亦將凝集。可用於測定對抗紅細胞的抗體的效價或鑒定人的血型。(b)在紅細胞表面,如果人為地使之吸附或結合特定的抗原物質,則與該抗原相對應的抗體將引起紅細胞凝集(被動凝集反應或間接凝集反應,psssive he-magglntination)。

  血凝及血凝抑制試驗

  有些病毒具有凝集某種(些)動物紅細胞的能力,稱為病毒的血凝,利用這種特性設計的試驗稱血球凝集(HA)試驗,以此來推測被檢材料中有無病毒存在,是非特異性的,但病毒的凝集紅細胞的能力可被相應的特異性抗體所抑制,即血球凝集抑制(HI)試驗,具有特異性。通過HA-HI試驗,可用已知血清來鑒定未知病毒,也可用已知病毒來檢查被檢血清中的相應抗體和滴定抗體的含量。

  [目的要求]

  掌握病毒HA和HI試驗的原理和基本操作方法,了解其實用價值。

  [材料與試劑]

  1. 96孔「U」形或「V」形微量反應板,50 uL定量移液器,滴頭,微型振蕩器。

  2. 生理鹽水,0.5%雞紅細胞懸液,新城疫病毒液(尿囊液或凍干疫苗液),新城疫陽性血清,被檢雞血清。

  [實驗內容及操作方法]

  (一)血球凝集(HA)試驗

  1. 在96孔微量反應板上進行,自左至右各孔加50 uL生理鹽水。

  2. 於左側第1孔加50 uL病毒液(尿囊液或凍干疫苗液),混合均勻后,吸50 uL至第2孔,依次倍比稀釋至第11孔,吸棄50 uL;第12孔為紅細胞對照。

  3. 自右至左依次向各孔加入0.5%雞紅細胞懸液50 uL,在振蕩器上振蕩,室溫下靜置后觀察結果(表4-1)。

  表4-1病毒血凝試驗的操作方法(單位:uL

  
孔 號123456789101112
病毒稀釋度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048對照
生理鹽水505050505050505050505050
病毒液5050505050505050505050
0.5%紅細胞505050505050505050505050
棄50
結果觀察++++++++++++++++++++++++​+++++--
4. 結果判定:從靜置后10 min開始觀察結果,待對照孔紅細胞已沉澱即可進行結果觀察。紅細胞全部凝集,沉於孔底,平鋪呈網狀,即為100% 凝集(++++),不凝集者(-)紅細胞沉於孔底呈點狀。

  以100% 凝集的病毒最大稀釋度為該病毒血凝價,即為一個凝集單位。從表4-1看出,該新城疫病毒液的血凝價為1:128,則l:128為1個血凝單位,1:64、l:32分別為2、4個血凝單位,或將128/4=32,即1:32稀釋的病毒液為4個血凝單位。

  (二)血球凝集抑制(HI)試驗

  1. 根據HA試驗結果,確定病毒的血凝價,配製出4個血凝單位的病毒液。

  2. 在96孔微量反應板上進行,用固定病毒稀釋血清的方法,自第1孔至第11孔各加50 uL生理鹽水。

  3. 第1孔加被檢雞血清50 uL,吹吸混合均勻,吸50 uL至第2孔,依此倍比稀釋至第10孔,吸棄50 uL,稀釋度分別為:1:2、1:4、1:8 …… ;第12孔加新城疫陽性血清50 uL,作為血清對照。

  4. 自第1孔至12孔各加50 uL 4個血凝單位的新城疫病毒液,其中第11孔為4單位新城疫病毒液對照,振蕩混合均勻,置室溫中作用10min 。

  5. 自第l孔至12孔各加0.5% 雞紅細胞懸液50 uL,振蕩混合均勻,室溫下靜置后觀察結果(表4-2)。

  4-2病毒血凝抑制試驗的操作方法(單位:mL

  
孔 號123456789101112
血清稀釋度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:1024病毒
對照
血清
對照
生理鹽水5050505050505050505050​
被檢雞血清50505050505050505050​50
4單位病毒505050505050505050505050
室溫中靜置 10 min
0.5%紅細胞505050505050505050505050
棄去50
結果觀察------++++++++++++++-
6. 結果判定:待病毒對照孔(第11孔)出現紅細胞100%凝集(++++),而血清對照孔(第12孔)為完全不凝集(-)時,即可進行結果觀察。

  以100%抑制凝集(完全不凝集)的被檢血清最大稀釋度為該血清的血凝抑制效價,即HI效價。凡被已知新城疫陽性血清抑制血凝者,該病毒為新城疫病毒。

  從表4-2看出,該血清的HI效價為1:64,用以2為底的負對數(-log2)表示,即6log2。

  

  1. 阿氏液(Alsever):即紅細胞保養液

  枸櫞酸鈉(5H2O) 0.80g

  枸櫞酸(H2O) 0.055g

  葡萄糖 2.05g

  氯化鈉 0.42g

  雙蒸水 加至 100 ml

  將以上試劑加熱溶解於雙蒸水中,調整pH至6.8,115℃滅菌10min,4℃保存備用。

  2. 0.5% 雞紅細胞製備方法

  先用滅菌注射器吸取3.8% 枸櫞酸鈉溶液(其量為所需血量的1/5),從雞翅靜脈或心臟采血至需要血量,置滅菌離心管內,加滅菌生理鹽水為抗凝血的2倍,以2000r/min離心10min,棄上清液,再加生理鹽水懸浮血球,同上法離心沉澱,如此將紅細胞洗滌三次,最後根據所需用量,用滅菌生理鹽水配成0.5%雞紅細胞懸液。

  3. 96孔微量反應板的清洗

  將浸泡有75%乙醇的棉簽放入微量反應板的每個孔內旋轉,用自來水沖洗反應板5次,再用蒸餾水沖洗3次以上,置37℃溫箱中乾燥。
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