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1 紫色桿菌素 -紫色桿菌素簡介

紫色桿菌素(violacein)圖1 是微生物產生的一種代謝產物,它屬於吲哚衍生物,是非水溶性的藍黑色色素,由兩個色氨酸分子氧化縮合而成。紫色桿菌素早在19 世紀就已被發現[1]。早期研究表明,色素能增加不產色素微生物的呼吸強度,從而認為是一種呼吸色素;由於高色氨酸濃度對菌體有損害,所以色素的合成與色氨酸調控有關,然而,在複雜的完全培養基中又有不產色素菌落,這表明色素對菌體的生存是非必需的次級代謝產物。
近年來,隨著研究的深入,紫色桿菌素展示出很重要的生物活性,可以作為潛在的抗腫瘤、抗病毒藥物及生物染料,有廣闊的應用前景,特別是近幾年,越來越受到人們的關注。圖2 是近80 年來美國國立生物技術信息中心(NCBI)收錄的紫色桿菌圖2 NCBI 收錄的紫色桿菌素相關文章統計(截止2007 年10 月1 日)素相關文章的統計。

2 紫色桿菌素 -微生物種類


產紫色桿菌素的微生物種類
從19 世紀人們發現Chromobacterium violaceum能夠產紫色桿菌素這一現象以來[1],又有不同的產紫色桿菌素微生物陸續被發現,但全部都屬於細菌,其中包括Moss 等[2]1978 年從河水中發現的 C.fluviatile,1956 年Sneath[3]發現的Janthinobacteriumlividum,1985 年McCarthy 等[4]發現的Alteromonasluteoviolacea , 及2002 年Egan 等[5] 發現的Pseudoalteromonas tunicata,2005 年溫露等[6]在中國南海中分離到的P. sp.。
在已發現的產紫色桿菌素的菌株中,對C.violaceum 的研究最為廣泛,同時發現C. violaceum是一個對動物及人類的機會致病菌[7-15],能夠導致致命的敗血病[7,16]。

3 紫色桿菌素 -生物合成機制


1.紫色桿菌素的結構及生物合成途徑
從1867 年發現C. violaceum 以來,人們對紫色桿菌素提取純化進行了研究[17-18]。1959 年,DeMoss等[19]發現色素中除了紫色桿菌素外還有另外一種含量較少的物質——脫氧紫色桿菌素(deoxyviolacein)。Ballantine 等[20]用降解及再合成的方法解析了紫色桿菌素及脫氧紫色桿菌素的化學結構(圖1),後來用光譜分析的方法得到了證明[21]。
解析紫色桿菌素生物合成途徑研究經過了一個很長的過程。起初,通過研究色氨酸及一些吲哚衍生物對紫色桿菌素合成的刺激來推測細菌體內合成途徑[22-26]。Momen 及 Hoshino [27]用同位素標記的底物進行培養實驗,發現紫色桿菌素中所有的C、H、N原子都來自色氨酸分子。羥化作用發生在色素合成的第一步,產生中間產物5-羥基色氨酸,說明分子氧參加這個氧化過程,也證明好氧條件對於紫色桿菌素的產生是必要的[22-25, 27]。在色素合成後期一個色氨酸的脫羧反應可能發生,進而產生紫色桿菌素及相關的化合物[22, 27]。2003 年,C. violaceum 全基因組測序完成[28],為紫色桿菌素合成途徑解析及應用提供了保證。但起初認為有4 個相關基因控制整個紫色桿菌素的生物合成[29-30],直到最近,第5 個基因才得以發現[31-33],整個代謝途徑基本明朗化。
從目前研究結果[24-26, 31-34]來看,紫色桿菌素的整個合成途徑中涉及5 個基因,且分佈在同一轉錄單元(圖3),根據不同酶的催化順序,紫色桿菌素合成過程可分為以下5 個步驟(圖4)
,相關的酶及其功能總結如表1 所示。
(1)VioA 酶對L-色氨酸氧化反應
VioA 是L-色氨酸氧化酶,相對分子質量為48kDa,依賴FAD。L-色氨酸是合成紫色桿菌素的唯一前體,當FAD 存在時,L-色氨酸經VioA 氧化脫氨,生成吲哚-3-丙酮酸(indole-3-pyruvic acid,IPA),體外該反應的最適pH 值為9.25。IPA 在NH4+存在時自發與異構體IPA亞氨互變(酮式與烯醇式互變)。
(2)VioB 酶對IPA 氧化反應
VioB 是一個氧化酶,相對分子質量為111 kDa,以二聚體形式存在,在反應體系pH 值7.0 時功能上類似星孢菌素(staurosporine)合成酶StaD、蝴蝶黴素(rebeccamycin)合成酶RebD,能夠合成chromopyrrolic acid(CAP)。以IPA 作為底物時VioB 酶反應的Km(Km 表示酶促反應速度最大速率一半時的底物濃度)為450 μmol/L,但在pH 值9.25時不能產生CAP。體外實驗表明,VioB 可能是紫色桿菌素整個合成過程的限速酶,體外表達時培養基中添加亞鐵血紅素前體δ-氨基乙醯丙酸和硫酸亞鐵銨VioB 才有生物活性。VioB 還具有過氧化氫酶活性2 個分子的IPA,在VioB 的作用下產生中間產物X(X 帶有兩個亞胺,具體結構還不清楚),此過程在VioB 不存在時也可自發進行。
(3)VioE 酶對中間產物X 催化反應
VioE 是最近才被發現的,相對分子質量只有22 kDa,位於整個基因簇的最末端,以二聚體形式存在。在VioE 的作用下,對未知的中間產物X 在吲哚環上發生1-2 轉變及脫羧反應,產生脫氧紫色桿菌素前體(prodeoxyviolacein)。該反應不需要輔酶及金屬離子,且VioA、VioB、VioE 3 種酶間不存在蛋白質間的相互作用。
(4)VioC、VioD 對脫氧紫色桿菌素前體的氧化反應
VioC、VioD 都屬於單加氧酶家族,包含黃素且對NAD(P)H 有依賴性,在合成途徑的後部分起作用,相對分子質量分別為48 kDa、42 kDa。VioC對脫氧紫色桿菌素前體、紫色桿菌素前體均起催化作用,體內一旦缺失,只能產生紫色桿菌素前體及deoxychromoviridans 、chromoviridans 、oxychromoviridans , 其中deoxychromoviridans 、oxychromoviridans 為綠色物質。添加NADPH 將明顯增加紫色桿菌素前體及紫色桿菌素的量,純化VioC 時結合輔酶因子FAD;VioD 只對脫氧紫色桿菌素前體起作用,體內缺失將只能產生脫氧紫色桿菌素。在體內作用過程是:脫氧紫色桿菌素前體在VioC 的氧化作用下產生脫氧紫色桿菌素(deoxyviolacein),在VioD 氧化作用下生成紫色桿菌素前體(proviolacein)。
(5)紫色桿菌素的生成
紫色桿菌素前體在氧化酶VioC 的催化作用下最終生成紫色桿菌素。通過以上5 個步驟酶催化,最終生成紫色桿菌素和脫氧紫色桿菌素混合物,其比例約10∶1。整個過程涉及14 個電子的傳遞。
2.紫色桿菌素髮酵工藝研究
目前, 紫色桿菌素的發酵研究主要以C.violaceum 為主(見表2)。研究表明[19, 22, 35-41],紫色桿菌素的產量與營養因子(如酵母提取物、蛋白腖、L-Try、Zn2+)、物理參數(pH 值、攪拌、溫度)有關,還受到群體效應(quorum sensing)分子N-己醯高絲氨酸內酯(HHL)的調節[42]。Mendes 等[40]用統計學的方法優化C. violaceum 產紫色桿菌素的條件,由最初的0.17 g/L 提高到0.43 g/L。但這個產量還比較低,不利於工業化生產,還應進一步發掘高產菌株,並以紫色桿菌素代謝調控理論為依據進行優化。

4 紫色桿菌素 -生物活性


1.紫色桿菌素的生物活性
自從1939 年Kidder 等[43]誤認為色素具有殺死纖毛蟲的活性以來,許多學者在各方面對紫色桿菌素生物活性進行了廣泛的研究並取得一定成果。紫色桿菌素生物活性的研究結果總結如下。
1.1 廣譜抗菌性
lichstein 等[44]用51 株細菌(包括21 個種)對紫色桿菌素粗提物進行抗菌實驗,發現紫色桿菌素對革蘭氏陽性細菌有顯著的抑制作用,對革蘭氏陰性細菌有較小的抑制性[43-44]。隨後,Duran 等[45]用純化后的紫色桿菌素進行抗菌實驗,表明純的紫色桿菌素與其混合物(紫色桿菌素+10%脫氧紫色桿菌素)抗菌效果一樣。同時,紫色桿菌素還可以抑制植物真菌病原菌(如Rosellinia necatrix,它可以導致桑樹根腐病),可以將紫色桿菌素作為殺真菌製劑[46]。在體外,紫色桿菌素具有抗分枝桿菌[Mycobacteriumtuberculosis (H37Ra)]活性,其最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)分別為64 μg/mL 和128μg/mL,這與在對肺結核進行化學療法中使用吡嗪醯胺(pyrazinamide)的濃度是相當的[47]。據文獻報道,紫色桿菌素主要抑制金黃色葡萄球菌(Staploylococcous aureus)、鏈球菌(Streptococcus sp)、芽孢桿菌(Bacillus sp)、分枝桿菌(Mycobacterium)、奈瑟球菌(Neisseria)及假單胞菌(Pseudomonas)[44,47-50],但是,它對一些革蘭氏陰性細菌抑制效果不好,如黃桿菌(F. balustinum)、黏質沙雷菌(S. marcescens)和大腸桿菌(E. coli)等[49]。
1.2 抗原生動物活性
紫色桿菌素具有殺錐蟲活性[22, 51-52]。但向白化病小鼠(18~20 g)腹膜內注射5×104 個錐蟲(T.cruz Y 型),然後注射紫色桿菌素及其衍生物(100mg/kg)7 天,僅減少4%發病率,此實驗說明紫色桿菌素在體內有較低的殺錐蟲活性[47]。紫色桿菌素具有抗利什曼原蟲(Leishmania)的活性,其EC50/24 h 為(4.3±1.15)μmol/L[53]。色素具有很強的抗氧化能力[54],可抑制原生動物捕食。
1.3 抗病毒性
紫色桿菌素混合物(含有10%脫氧紫色桿菌素)對侵染Hela 細胞的單純性皰疹病毒(herpes simplexvirus,HSV)、脊髓灰質炎病毒(polioviruses)有抵抗活性[55 - 57],當紫色桿菌素混合物濃度為0.25μg/mL、0.063 μg/mL 時,可以分別抑制62%的單純性皰疹病毒和56%的脊髓灰質炎病毒。
1.4 抗腫瘤細胞
紫色桿菌素對成纖維細胞(V79)系有很高的細胞毒素活性[51, 58]。對V79 細胞的 IC50 在5~12 μmol,這也說明了紫色桿菌素是通過誘導V79 細胞程序性死亡而起作用的。隨後實驗表明,紫色桿菌素對白血病細胞(leukemia cells)、淋巴瘤(lymphoma)、肺、結腸[59-60]以及由艾滋病毒(AIDS)引起的淋巴瘤[61]都有很好的細胞毒性作用,細胞的核酸物質從形態上發生改變(包括染色體凝聚、核苷酸量的減少)[59]。紫色桿菌素對結腸癌細胞凋亡過程產生的活性氧簇物(reactive oxygen species,ROS)有很大的影響[62],它通過激活半胱天冬酶、釋放細胞色素C、釋放Caco-2 細胞的鈣到硫戊巴比妥鈉來調節活性氧簇物,還發現紫色桿菌素在Caco-2 和HT29 細胞中對ROS 影響不同,說明紫色桿菌素在不同類型的細胞中有不同的機制。Kodach[63]研究認為,紫色桿菌素有助於增加5-氟尿嘧啶細胞毒性,誘發細胞程序性死亡,抑制Akt 磷酸化作用,終止信號轉導,這表明紫色桿菌素在治療結腸癌細胞時有效,在克服5-氟尿嘧啶的抗性上很有前景。在研究紫色桿菌素致使人的白血病細胞壞死的分子機理[64]時發現:紫色桿菌素能致使HL60 白血病細胞程序性死亡,但是對其它類型的白血病細胞、人正常淋巴細胞及單核細胞沒有作用。紫色桿菌素經半胱天冬酶激活、核因子kB(NF-kappa B)轉錄及p38 有絲分裂原(細胞分裂劑)激活蛋白的激活后對HL60 細胞產生毒性。紫色桿菌素生物活性效應類似於這些細胞中腫瘤壞死因子α(tumor necrosisfactor alpha,TNF-α)信號轉導。此外,紫色桿菌素可以直接激活腫瘤壞死因子(TNF)受體1 信號途徑,因此,紫色桿菌素是一類新的通過激活腫瘤壞死因子受體1(TNF receptor 1)來調節HL60 細胞程序性死亡的細胞毒類藥物。
1.5 遺傳毒性
除了以上對人類有益的生物活性外,紫色桿菌素還具有一定的遺傳毒性[65]。通過鹼性「彗星」法、微核實驗發現,當紫色桿菌素濃度為0.19~1.5μmol/L 時對HEp-2 及 MA104 細胞系無明顯致DNA 損傷作用,但是對FRhK-4 及「維洛」細胞(VERO cells)DNA 有損害作用,微核實驗也表明紫色桿菌素對「維洛」細胞(VERO cells)是陽性。
1.6其它功能
紫色桿菌素能抗可見光輻射[34],此外,紫色桿菌素可代替人工色素作為染料,對天然原料(如絲綢、棉、毛)及合成原料(如尼龍)都有很好的著色效果[46]。
2.紫色桿菌素的改造
為了提高紫色桿菌素的生物活性及減小其毒性,人們採用與其它物質絡合的方法,即輕微改變特定基團的策略。
紫色桿菌素通過與β-環糊精形成絡合物,能明顯降低色素毒性,提高抗腫瘤活性[66]。分析表明,通常β-環糊精包埋色素分子的極性部分,形成1∶2絡合物。形成絡合物后,對E. coli 急性毒性沒有改變,但是對V79 細胞毒性顯著降低;在100 μmol/L時對紅細胞脂質過氧化損傷的抑制率提高30%,在500 μmol/L 時則完全抑制(而單色素抑制率只有65%)[67]。此外紫色桿菌素-β-環糊精絡合物能顯著抑制胃潰瘍的發生,提高抗脂氧化酶的活性[68],能誘發HL60 細胞的程序性死亡[69]。Bromberg 等[70]用各種氧化酶對紫色桿菌素進行修飾,發現辣根過氧化物酶複合物Ⅱ在反應中出現,漆酶能快速轉化紫色桿菌素分子。

5 紫色桿菌素 -應用前景


紫色桿菌素應用展望及存在的主要問題
鑒於紫色桿菌素的生物活性功能,紫色桿菌素作為一種潛在的抗腫瘤、抗病毒藥物在醫學上具有良好的應用前景,但同時也存在一些需要解決的問題:(1)目前對紫色桿菌素應用過程中的毒副作用研究甚少,應當加強研究,為其進入臨床階段奠定基礎;(2)紫色桿菌素有一定的遺傳毒性,怎樣提高其生物活性、降低其毒性並且和其它抗腫瘤抗病毒藥協同作用是今後研究的重點;(3)紫色桿菌素具有很強的生物活性,還可作為生物染料,有很好的應用前景,但是微生物生產紫色桿菌素的產量普遍較低(0.43 g/L)[40],目前還沒有紫色桿菌素的基因工程菌株構建的研究報道,因此篩選高產菌株及構建基因工程菌是其大規模應用中需要解決的重要問題。(4)目前研究都集中在紫色桿菌素上,而對其副產物脫氧紫色桿菌素的生物活性沒有進行研究,兩者的生物活性有差別嗎?從對脫氧紫色桿菌素的生物作用特性及紫色桿菌素生產技術研發的角度看,對脫氧紫色桿菌素的研究是有必要的。紫色桿菌素應用到腫瘤治療、抗病毒及紡織工業有很廣闊的前景,但中國在這方面研究甚少;關於紫色桿菌素研究工作主要在國外展開,並且有關內容已經申請到國際專利進行保護[60, 71-73],在將來的應用中由於知識產權的壁壘,對中國相關企業會產生不利的影響。因此,中國相關領域的學者應加強對紫色桿菌素基礎及應用研究,包括紫色桿菌素的進一步藥理實驗,以及高產紫色桿菌素菌株的篩選、基因工程菌的構建、發酵工藝的優化等。

6 紫色桿菌素 -成熟產品


紫色桿菌素(violacein,Vio)是細菌以L-色氨酸為前體物合成的一種藍紫色的非水溶性次級代謝產物,屬於吲哚衍生物,由兩個色氨酸分子氧化縮合而成。Vio不僅具有良好的著色效果,還具有廣譜抗菌、抗病毒、抗氧化、抗原生動物、抗腫瘤等多種重要生物活性,可作為潛在的抗腫瘤、抗病毒藥物及保健類天然色素。
來源:弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)基因工程菌株
產品特性:藍紫色固體粉末
產品規格:50mg/瓶、100mg/瓶、200mg/瓶
產品貯存條件:用玻璃瓶盛裝,4℃避光保存
CAS號:548-54-9
經驗分子式:C20H13N3O3
分子量 343.34
溶解性:溶於甲醇、乙醇、丙酮、二甲基亞碸,不溶於水
貯存溫度:2-8℃
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