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細胞化學是研究細胞的化學成分及其在細胞生命活動中的變化和定位的學科。發展趨勢是定量細胞化學,即在不破壞細胞形態結構的狀況下,用生化的和物理的新技術對各種組分做定量的分析,研究其動態變化,了解細胞代謝過程中各種細胞組分的作用。  

細胞化學細胞化學

細胞化學是研究細胞的化學成分及其在細胞生命活動中的變化和定位的學科。發展趨勢是定量細胞化學,即在不破壞細胞形態結構的狀況下,用生化的和物理的新技術對各種組分做定量的分析,研究其動態變化,了解細胞代謝過程中各種細胞組分的作用。        

1 細胞化學 -研究簡史

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細胞化學和組織化學的發展是分不開的,都建立在細胞學、組織學以及生物化學的基礎上。19 世紀初葉,法國植物學家F·V·拉斯帕伊在1825~1829年研究禾本科植物的受精作用時,首次發現了澱粉的碘反應,他還建立了蛋白質的黃色反應(xanthoproteic reaction),硫酸對於糖醛及蛋白質(色氨酸)的醛基反應等鑒定方法,因此他被認為是組織化學的創始人。

動物方面的組織化學和細胞化學的研究開展較晚。M.珀爾斯1867年用普魯士蘭顯示細胞的鐵質,H·I·克文克 1868年用黃色硫化胺溶液(NH4)2S和鐵質化合成為黑色的硫化亞鐵等方法,至今仍在應用。1844年A·N·E·米利翁敘述了他的蛋白質反應,但是1853年R.霍夫曼指出,這個反應實際上是一個測定酪氨酸的方法,直至1888年,H.萊特格爾才使用米氏反應,E.克萊布斯1868年和H·施特魯韋1872年首次顯示出組織中酶的存在。他們指出樹膠酊遇膿變成藍色,這是確定組織中有過氧化物酶存在的首次報道。1895年P.埃爾利希用「納笛」反應首次顯示細胞色素氧化酶。在異色性方面,甲基紫顯示糖蛋白(1875);天竺牡丹顯示肥大細胞、唾液腺粘液(1890);雜硫氧苯染料如亞甲藍、硫堇、亞甲綠、甲苯胺藍、天青藍等對多糖的異色性染色亦相繼被發現。

組織化學、細胞化學是在形態學和生物化學已有一定基礎,苯胺染料技術發展到高峰的20世紀40年代才活躍起來的。A.本克1862年首次應用苯胺染料,這是組織學方法上的一次革命。1936年比利時的組織化學家L.利松的《動物組織化學》一書總結了組織化學的優缺點及發展的方向,把組織化學推向高潮。

發展比較快的是定量細胞化學及定量組織化學,其目的是對細胞、細胞的組分和細胞外的產物,在其原位上和活的情況下進行定量化學分析,主要包括兩個方面:其一細胞光度學是對細胞內某些化學物質的光學上的數量進行分析。最常用的方法為:①吸收量度法,適用於對細胞內化學反應最終反應產物 (FRP)的吸收光(紅內到紫外)或 X射線的定量測定;②熒光測定法僅限於應用對熒光性的FRP的定量測定;③干涉量度法一般用來測定半透的FRP或整個細胞內干物質的定量測定;④反射量度法僅用於對細胞內顆粒沉積物的定量測定,如銀顆粒。其二原位定量測定包括對切片厚度的測定,對一個特殊細胞化學反應區域的定量測定,放射自顯影的顆粒的計數和自動影像分析。自動影像分析是將光掃描系統(如掃描顯微光密度測定法)和電子計算機連在一起進行定量分析,是定量細胞化學分析細胞內化學物質的最好方法。

1982年日本大田用分子細胞化學方法研究染色質的結構、功能,了解到一些真核細胞DNA複製機制以及基因的表達調控等。如已揭示SV40核蛋白複合物(SV40染色質)具有一個與真核細胞相似的核小體結構,可做為研究染色質的結構與功能的模型。1983年他又把細胞化學技術與超微結構結合研究了SV40染色質的轉錄和複製,並對細胞的染色質進行了討論。

2 細胞化學 -研究方法

細胞化學的染色法 

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染料可以是鹼性的(如亞甲藍)或酸性的(如依紅)。酸性染料的生色基團是硝基(-NO2)和醌基細胞化學;鹼性染料的生色基團,包括著偶氮基(-N=N-)胺基〔或吲達胺基(-N=)〕。染色的原理是基於在酸性染料中具有染色作用的陰離子和細胞內的鹼性物質相結合,而鹼性染料中的陽離子和細胞內的酸性物質相結合,所以酸性的細胞成分被鹼性染料所染色,而鹼性的細胞組分則被酸性染料染色。例如顯示蛋白質所用的米氏反應,其中硝基汞試劑作用於細胞中蛋白質側鏈上的酪氨酸基,形成紅色沉澱,在重氮基反應中氫氧化重氮與酪氨酸、色氨酸和組氨酸基反應形成有顏色的複合物。某些碳水化合物、酯類和 DNA可用對其醛基有特異結合的試劑,如雪夫氏試劑顯示之。染核酸的方法與核苷酸磷酸、碳水化合物和嘌呤及嘧啶的三種成分的特性有關。DNA和RNA能吸收 260納米波長的紫外光是由於氮基的存在。DNA 分子內的去氧戍糖與孚爾根氏反應有關。DNA及RNA的嗜鹼性又與其分子中磷酸根有關,因此,鹼性染料如天青能與DNA及RNA產生特異性反應,甲基綠染DNA也是由於磷酸根的存在。

原位細胞化學 
顯微細胞化學方法多是把單層的培養細胞,或把恆冷箱製備的新鮮而又薄的冰凍切片放在一定溶液內溫育,使待測的物質或酶與染料或試劑發生專一性的反應,要求在原位上直接形成或變為不溶解的產物。有顏色的產物用光學顯微鏡,熒光產物則用熒光顯微鏡,吸收紫外光的物質用石英或反射顯微鏡,觀察其在細胞結構上的分佈。高電子密度產物可在電子顯微鏡下觀察。

酶的細胞化學 
一般是將薄的冰凍切片用適宜的底物溫育,來測定酶在細胞內的位置。 組織化學家格莫里在測定鹼性磷酸酶時是用甘油磷酸鈉為底物,酶水解釋放的磷酸根與底物溶液中的某些離子結合產生非溶性的金屬鹽,后又轉變成金屬鉛,硫化鉛,硫化鈷及其他有色的化合物而得以顯示出來;另一種方法是用β-萘酚的磷酯作為底物,酶水解釋放出的β-萘酚,在有重氮鹽存在時立即結合,因而在酶活動位置產生有顏色的偶氮化合物,其他水解酶,例如脂酶、酸性磷酸酶、硫酸脂酶和β-葡萄糖苷酶,也是根據這種原理,改變一些條件和相應的底物以顯示之。 氧化酶能催化供體的電子轉移到氧原子上,它們有的含鐵,如過氧化物酶和過氧化氫酶,有的含銅,如酪氨酸酶和多酚氧化酶。可用無色的底物,如聯苯胺來驗測過氧化物酶,在酶存在處由於過氧化氫的作用,這些底物會轉變為可染色的染料,聯苯胺反應是由於過氧化物酶能把聯苯胺氧化為藍色或棕色的產物,細胞色素氧化酶能氧化納笛氏試劑中α-萘酚和二甲基對苯二胺氧化成靛酚藍染料。3′,3′-二氨基聯苯胺試劑可用來在電子顯微鏡下研究過氧化物酶和細胞色素氧化酶。

細胞化學示意圖

脫氫酶能從底物中將電子轉移到氧化試劑上或電子體上。四唑鹽為受氫體在反應中由脫氫酶將底物氫原子轉移到四唑鹽而形成有色的甲(formazan)在局部沉澱,顯微鏡下可判明該酶的定位。四唑鹽種類甚多,最常用的是硝基藍四唑鹽(簡稱(Nitro BT),Nitro BT類染料顯示何種脫氫酶,則由所用底物而定,如用琥珀酸鈉,甲是琥珀酸脫氫酶作用下的產物,用乳酸鈉或蘋果酸鈉則是乳酸脫氫酶或蘋果酸脫氫酶作用的結果。但有些脫氫酶須有輔酶Ⅰ(NAD+)或輔酶Ⅱ(NADP+) 才能發生作用,顯示這種脫氫酶時須另加所需的輔酶,輔酶Ⅰ、輔酶Ⅱ或黃素蛋白(FAD或FMN)可做為氫接受體,當NAD+和NADP+接受脫氫酶釋放的氫時,它們即成為還原NAD(即NADH)和還原NADP(即NADPH) (見示意圖)。

3 細胞化學 -研究方法

利用物理學技術研究各種細胞組分。

細胞光度法 
其原理是利用某些細胞組分吸收紫外光的不同特點,如核酸吸收光波是260納米,蛋白質是280納米,有些染色反應產物也有對可見光譜的特異吸收能力,用細胞光度計進行定量分析(見表)。

細胞化學表1

核酸有特異的紫外光吸收能力是因為它有嘌呤和嘧啶基,因此,DNA、RNA和核苷酸吸收能力相同。孚爾根氏反應只顯示 DNA的存在,適合於定量測定在切片中的DNA。米氏反應可用來測定蛋白含量。

熒光顯微鏡  
可用以檢測細胞的自發熒光和與熒光染料結合后的熒光。有些化合物受到紫外光照射時,能吸收輻照,併發出可見光,稱自發熒光。有些化合物或細胞組織的成分,本身不發熒光,但能有選擇的吸收不同的熒光性物質(熒光染料),因而也能發熒光稱次級熒光;這種顯示方法稱熒光染色法。利用自發熒光或吸收熒光素來鑒定細胞組織的物質,如維生素、類脂質、色素、致癌物,一些其他偶氮染料,奎寧、磺胺類、青霉素等藥品,鈾及其他金屬衍化物等已日見重要,特別是腫瘤細胞的鑒定及抗體抗原的顯示。熒光鑒定的一個重要進展是發現用副甲醛固定冰凍乾燥的組織與兒茶酚胺和吲哚胺產生泠凝作用,可相應地發散綠色和黃光熒光。利用此種熒光反應結合顯微分光攝像法已對交感神經節中小強熒光(SIF)細胞內兒茶酚胺的性質進行了研究。

免疫細胞化學 
用標記的抗體測定細胞內的抗原。應用此種技術能在光學和電子顯微鏡水平下找出抗原的位置。一般常用的是A.H.孔斯氏技術,抗體用熒光異氰酸鹽偶聯的抗體。直接顯示法主要步驟是先將組織驟冷,製成薄的切片,然後用偶聯的抗血清染色。常用的是間接顯示法,其原理是用熒光染料或一種酶標記的第二抗體來加強第一抗原-抗體反應。常用的是過氧化物酶,它在有啹O2存在時與DAB(3′,3′-diaminobenzidin)相反應,產物是電子密度大的沉積物,用光學顯微鏡和電子顯微鏡均可檢測。 在免疫電鏡細胞化學的研究中,1974年I.W.麥克萊恩和P.K.納卡內曾發現應用副甲醛混合液能使細胞內抗原更為穩定。1976年文德爾沙弗 -克拉布等發現用未標記抗體酶方法研究病毒的抗原的超微結構定位要比應用鐵蛋白標記抗體要成功的多,同時發現將組織塊切成薄片后包埋、溫育、染色,比將組織塊包埋前溫育、染色為優。 這種方法在細胞生物學中日益顯示出重要性,許多細胞骨架蛋白,例如微管蛋白、肌動蛋白、調鈣蛋白等均可用免疫細胞化學原理找到它們在細胞內的位置,隨著生化提純的蛋白質的加多,免疫細胞化學還會得到更廣泛的應用。

細胞化學鹼性磷酸酶細胞化學定位觀察

核的細胞化學、定量細胞化學 
如孚爾根氏反應及甲基綠(焦寧或派羅寧)染色表明 DNA只存在於染色質及染色體內,核仁主要是RNA。孚爾根氏反應是用雪夫氏試劑(亞硫酸品紅)來染稀鹽酸水解后的 DNA使之成為紫紅色沉澱,因為這一反應結果較為穩定,所以在用細胞光度計測定染色切片上細胞核的 DNA含量時多用此法著色,並從色的深淺來計算含量,進一步又採用棓花青染色來測細胞質的 RNA,1899年A.帕彭海因用甲基綠焦寧G染色法,對細胞內DNA及RNA染色,使DNA染成綠色,RNA染成紅色。吖啶橙是專染核酸的熒光素,RNA多呈紅色熒光,次為黃色,最弱的呈綠色。因為腫瘤細胞一般含有較多的RNA,曾做為鑒定腫瘤細胞的一種方法。在超薄切片上染DNA及RNA也發展了多種染色技術,常規應用溴酸氨絡合物,其反應可能是一種類似孚爾根氏的反應。染色后DNA出現特異性著色,對比鮮明,此技術可顯示病毒感染的細胞核內30埃的病毒DNA細絲。

核的蛋白質定量測定多應用萘酚黃S及二硝基氟苯染色法。此法定量可靠,假若將萘酚黃 S與孚爾根氏反應結合在一起應用,則蛋白質與DNA的著色,就互不影響。有的學者應用這種技術研究核內非組蛋白蛋白質。指出核內非組蛋白蛋白質系由基因調節蛋白質所組成。因此,對其定量研究日趨重視。在轉錄活動有重大改變時,常伴隨著此種蛋白質的增加,如用這種聯合染色方法對此種蛋白質進行定量測定,可證明生長旺盛的細胞中非組蛋白蛋白質與DNA的比率較靜止期細胞為高。 用副品紅孚爾根氏反應可對 DNA與蛋白質同時染色和測定,再用吖啶黃-茚三酮染色,然後除去非特異性熒光,即可在同一個細胞上同時測定蛋白質及 DNA的含量,此技術曾應用於婦科細胞學塗片標本以鑒別癌細胞。        

4 細胞化學 -展望

細胞化學親和細胞化學實驗方法

將細胞超微結構與局部的化學分析聯繫起來,將會對研究細胞成分方面起重要作用,還要為自動影像分析技術提供更多的新染色方法,使細胞組分著色對比清晰,以便對細胞精細結構進行定量測定。也應發展電視分析的定量細胞化學,通過電視系統大大發展影像分析技術,以便迅速獲得處理的數據。

定量細胞化學雖是細胞化學發展的主要方向,但仍有不少困難。有關儀器方面的問題已逐漸得到解決;但在固定細胞,反應的化學計算方法和反應產物的彌散等方面仍存在不少困難。突出的問題是如何分離出組織的需要容量:如在分離血球或離體培養的細胞還比較容易,而在組織切片中幾乎仍然是不可能的。最關鍵的是需要應用更多的技術方法,以便相互驗證檢查。在所有情況下,還必須建立合適的標準或模式系統。判斷任何定量細胞化學方法均有賴於用正確的模式系統還要與其他方法所得的結果進行比較,方能滿足今後研究的需要。

5 細胞化學 -參考資料

[1] 大科普網 http://www.ikepu.com/biology/biology/branch/cytochemistry_total.htm
[2] 澤澤網 http://www.zzgwu.com/wiki/index.php?doc-view-552851

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