標籤:動物細胞工程

細胞系(cell line)指原代細胞培養物經首次傳代成功后所繁殖的細胞群體。 也指可長期連續傳代的培養細胞。

1簡介

經過40-50次分裂的渡過第二次死亡危機的細胞,稱之為細胞系。如細胞系的生存期有限,則稱之為有限細胞系(FiniteCellLine);已獲無限繁殖能力的細胞系,稱連續或無限細胞系
建立細胞系流程圖

  建立細胞系流程圖

(InfiniteCellLine)。無限細胞系大多已發生異倍化,具異倍體核型,可能成為惡性細胞,因此本質上已是發生轉化的細胞系。無限細胞系有永生性(不死性),但仍保留接觸抑制和無異體接種致死;有的有永生性,異體接種有致瘤性,說明已惡性化。由某一細胞系分離出來的、在性狀上與原細胞系不同的細胞系,稱亞系(Subline)。

2概念分歧

現行的人教社大綱版選修教材中是這樣介紹細胞株和細胞系的:
原代培養的細胞一般傳至10代左右就不容易傳下去了,細胞的生長就會出現停滯,大部分細胞衰老死亡。但是有極少數的細胞能夠度過「危機」而繼續傳下去,這些存活的細胞一般能夠傳到40--50代,這種傳代細胞叫做細胞株。細胞株的遺傳物質沒有發生改變。當細胞傳至50代以後又會出現「危機」,不能再傳下去。但是有部分細胞的遺傳物質發生了改變,並且帶有癌變的特點,有可能在培養條件下無限制地傳代下去,這種傳代細胞稱為細胞系。
GENE 細胞系

  GENE 細胞系

在一些別的資料中,細胞株和細胞系的概念與我們教材上的說法正好相反。課標教材沒有再介紹這一對概念。這又是為什麼呢?人教社編輯包春瑩老師(bcying)對這一疑點的解釋:細胞系和細胞株,兩者曾一度混用,導致有些文獻中概念不清。下面所指的概念是2013年國內外比較通用的,也是絕大多數研究者接受的觀點。
原代培養物經首次傳代成功即稱為細胞系(CellLine),因此細胞系可泛指一般可能傳代的細胞。其中能夠連續傳代的細胞叫做連續細胞系或無限細胞系,不能連續培養的稱為有限細胞系。大多數二倍體細胞為有限細胞系。通過選擇法或克隆形成法從原代培養物或細胞系中獲得具有特殊性質或標誌物的培養物稱為細胞株(CellStrain),也就是說,細胞株是用單細胞分離培養或通過篩選的方法,由單細胞增殖形成的細胞群。細胞株的特殊性質或標誌必須在整個培養期間始終存在。

3腫瘤細胞

這是現有細胞系中最多的一類,中國已建細胞系主要為這類細胞。腫瘤細胞系多由癌瘤建成,多呈類上皮型細胞,常已傳幾十代或百代以上,並具有不死性和異體接種致瘤性。
對已建成的各種細胞系或細胞株習慣上都給以名稱;細胞的命名無嚴格統一規定,大多採用有一定意義縮寫字或代號表示。但不論什麼形式,均不宜太長,以便記憶和了解,今別舉以下幾種代表性的細胞名稱供參考:
X射線誘導4種細胞系的DNA損傷與劑量的關係

  X射線誘導4種細胞系的DNA損傷與劑量的關係

HeLa:為供體患者的姓名(來源於宮頸癌)
CHO:中國地鼠卵巢細胞(ChineseHamsterOvary)
宮-743:宮頸癌上皮細胞,1974年3月建立
NIH3T3:美國國立衛生研究所(NationalInstituteofHealth)建立;每3天傳代,每次接種3×105細胞/毫升。

4建立要求

什麼樣的體外培養群可被認可為己鑒定的細胞,視具體情況而定,無統一規定。對於用作原代培養的細胞只要供體均一,取材部位及組織種類等條件穩定即可,如用做長期培養,特別是反覆傳代的細胞,常需做如下說明:
1、組織來源:細胞供體所屬物種,來自人體或者動物;個體性別、年齡;取材的器官或組織。如系腫瘤組織,應說明臨床和病理診斷,以及病歷號等。
2、細胞生物學檢測:
了解細胞一般和特殊的生物學性狀,如細胞一般形態,特異結構,細胞生長曲線和分裂指數,倍增時間,接種率等。如為腫瘤細胞,為說明來源於原腫瘤組織並保持惡性,須做軟瓊脂培養,異體接種致瘤和對正常組織侵潤力等實驗。
3、培養條件和方法;應說明細胞系(或株)適應的生存環境,即指明使用的培養基、血清種類、用量以及適宜PH值。

5建株要點

腫瘤細胞培養技術要點
1、取材:材料主要來源於外科手術或活檢瘤組織,取材時避免用壞死組織,要挑選瘤細胞集中和活力較好的部位,瘤性轉移淋巴結或胸腹水是較好的培養材料。取材后儘快培養,因故不能立即培養者,可凍存。其培養方法及凍存方法同前述正常組織。
2、成纖維細胞排除:在腫瘤組織中常混雜有一些成纖維細胞,培養時能與瘤細胞同時生長,並常壓過癌細胞,導致癌細胞生長受阻以至消失,應仔細排除。排除方法常有:機械刮除法、反覆貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法等。
紅細胞系

  紅細胞系

3、提高腫瘤細胞培養存活率和生長率
根據實驗經驗,腫瘤細胞在體外不易培養,建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。一般當腫瘤組成或細胞被原代培養后,要經過對新環境的適應才能生長,因此不能局限於一般培養法,須採用一些特殊措施。如:用適宜底物,鼠尾膠原底層及飼細胞底層等。用細胞生長因子,根據細胞種類不同選用不同的促細胞生長因子,如胰島素、氫化可的松,雌激素等。也可以考慮動物媒介培養。

6淋巴母

l、4ml肝素抗凝血於離心管中,加入2mlRPMI1640。
2、混勻后沿管壁緩慢加到預置有4ml淋巴細胞分離液的液面上靜置30min。
3、1500rpm,15min,吸取白細胞層(第二層)於另一離心管中。
4、加RPMI16405ml洗滌白細胞兩次。
5、將白細胞接種至1mlRPMI1640培養基中,加入10μl環胞黴素和100μl的EBV(EB病毒)液,混勻。
6、水浴搖床,40次/分,37℃,3hr。
7、1500rpm,15min。將細胞接種至1ml培養基中(內含谷氨醯胺1mM/ml)加入10μl環胞黴素,輕輕混勻,37℃培養。
8、5天後觀察細胞轉化和生長情況,決定是否半量換液。一般半量換液l—2次,並維持環胞黴素的濃度。
9、待轉化細胞數量明顯上升,並出現細胞團塊后,可轉入25ml細胞培養瓶中,加1—2ml培養基,37℃培養10—15天,一般每隔3—4天觀察一次,決定是否換液,傳代。
10、細胞生長達一定數量后凍存,凍存前應進行核型分析和存檔。

7鑒定管理

各國情況
國際上美、英和日本等國已建有細胞庫;美國已有美國標準細胞庫或細胞銀行(ATCC)和人遺傳突變細胞庫(HGMR)、細胞衰老細胞庫(CAR)等,其中ATCC不僅是美國也世界最大的細胞庫。ATCC下屬有一組協作實驗室和一個由眾多專家組成的諮詢委員會。ATCC也是美國國立癌症研究所(NCI)和美國衛生研究所中(NIH)的資源庫,尤與NCI有密切的關係。ATCC也是世界衛生組織WHO的國際培養細胞文獻中心。ATCC現液氮凍存有3200個已經過鑒定的細胞系(1992),其中包括來自正常人和各種疾病患者的皮膚成纖維細胞系;和來自不同物種的近75個雜交瘤細胞株。ATCC接納來自世界各國已經鑒定的細胞予以貯存,同時也向世界各國的研究者或實驗室免費提供研究用細胞(做盈利性研究時收費。)

檢測項目

ATCC接納入庫細胞時,必須符合其入庫標準,ATCC入庫細胞要求檢測項目如下:
培養簡歷:組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正常或異常健康狀態、細胞已傳代數等
凍存液:培養基和防凍液名稱
細胞活力:融解前後細胞接種存活率和生長特性
培養液:培養基種類和名稱(一般要求不含抗生素)、血清來源和含量
細胞形態:類型,如為上皮或成纖維細胞等,融解后細胞生長特性
核型:二倍體或多倍體,標記染色體的有無
無污染檢測:包括細菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等
物種檢測:檢測同工酶,主要為G6PD和LDH,以證明細胞有否交叉污染以及反轉錄酶檢測
免疫檢測:一兩種血清學檢測
細胞建立者:建立者姓名;檢測者姓名
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