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細菌內毒素,英文稱作Endotoxin,是G-菌細胞壁個層上的特有結構,內毒素為外源性致熱原,它可激活中性粒細胞等,使之釋放出一種內源性熱原質,作用於體溫調節中樞引起發熱。細菌內毒素的主要化學成分為脂多糖。.

1出現時間

細菌內毒素
細菌內毒素這個概念在1890年的時候就已被提了出來,它是在研究發熱物質過程所引起的,1933年Boivin最先由小鼠傷寒桿菌提取出來,進行化學免疫學方面的研究,到1940年時候,Morgan使用志賀氏痢疾菌闡明了細菌內毒素是由多糖脂質及蛋白質三部分所組成的複合體,到了1950年以後,隨著生物學,物理化學,免疫學以及遺傳學等的進步發展,細菌內毒素的研究工作,尤其是其化學結構組成及各種生物活性間的關係也更加明確起來。
細菌英文叫Bacteria:為原核生物中的一類單細胞微生物由二分裂法繁殖。若按革蘭氏染色法可將細菌分為G+菌和G-菌兩大類。這兩類細菌細胞壁的結構和化學組成存在很大差異。唯有肽聚糖為其共同成分,但其含量的多少和肽鏈的性質有所不同,見上圖表。

2結構構造

細胞壁較薄,厚約10-15nm,結構也較複雜。肽聚糖含量低,僅占細胞干生10%左右,層薄又較疏鬆,因肽聚糖之間僅四肽側鏈直接聯結,缺乏五肽橋;肽聚糖居於細胞最內層,外面由內向外還有脂蛋白,外膜和脂多糖的三層聚合物。
蛋白質
脂蛋白(lipoprotein) 由類脂和蛋白質構成,聯結在外膜與肽聚糖層之間,類脂一端經非共價鍵聯結到外膜的磷脂上,另一端由共價鍵聯結到肽聚糖肽鏈中的二氧基庚二酸殘基上,使外膜和肽聚糖層構成一個整體。
外膜
外膜(outer membrane) 是革蘭氏陰性菌細胞壁的重要結構,位於肽聚糖的外側,其結構類似細胞膜,為磷脂雙層,其中鑲嵌一些特異蛋白質,穿透外膜的內外雙層。外膜外層分佈著脂多糖分子。外膜中間有微小孔道,容許水溶性的小分子通過,以進行細胞內外的物質運輸和交換。除此之外,外膜還能防止胰蛋白酶和溶菌酶等進入,起到保護性屏障作用。
脂多糖
脂多糖(lipopolysaccharide,LPS) 由多糖O抗原、核心多糖和類脂A(lipid A)三部分組成(圖1-8),位於革蘭氏陰性菌外膜外層。多糖O抗原是由若干個低聚糖的重複單位組成的多糖鏈,有特異性。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脫氧辛酸(2-keto-3-deoxyoctonic acid, KDO)等組成。類脂A是脂化的葡萄胺二糖,通過焦磷酸酯鍵組成的一種獨特的糖脂化合物,具有致熱作用,是革蘭氏陰性細菌內毒素的毒性成分。
細菌內毒素即:許多病原性細菌所產生的毒素。

3分類

一般細菌毒素可分為兩類,一類為外毒素(Exotoxin);它是一種毒性蛋白質,是細菌在生長過程中分泌到菌體外的毒性物質。產生外毒素的細菌主要是革蘭氏陽性菌。如白喉桿菌、破傷風桿菌、肉毒桿菌、金黃色葡萄球菌以及少數革蘭氏陰性菌。另一類為內毒素(Endotoxin)。是革蘭氏陰性菌的細胞壁的產物。細菌在生活狀態時不釋放出來,只有當細菌死亡自溶或粘附在其它細胞時,才表現其毒性,內毒素的主要化學成分是脂多糖中的類脂A成分。

4生物活性

1、致熱性。2、致死性毒性。 3、白細胞減少。4、Shwartzman反應。5、降低血壓,休克6、激活凝血系統。7、誘導對內毒素的耐受性。8、鱟細胞溶解物(鱟試劑)的凝集。9、刺激淋巴細胞有絲分裂。10、誘導抗感染的特異性抵抗力。11、腫瘤細胞壞死作用。

5量值

在80年代以前,所有研究內毒素的報道,毫無例外地使用重量單位表示內毒素的量,在鱟試劑建立后也同樣以重量單位表示鱟試驗的靈敏度。隨著人們對細菌內毒素生物活性認識的提高,以重量單位表示的不科學性被揭示,即相同重量的內毒素,對於菌種來源不同,其生物活性相差很大。1980年美國學者Hochstein完成了將重量單位轉化為內毒素單位的工作。當時美國內毒素參考標準品代號為EC-2,該品的家兔發熱劑量ED50為1.04ng/kg,而與此同時美國食品藥品管理局(FDA)批准的鱟試劑參考品為第四批,FDA邀請當時已獲有鱟試劑生產許可證的製造商進行協作研究,採用EC-2與第四批鱟試劑參考品,求出兩者的凝聚終點用ng/ml表示,四個實驗室的56次單獨試驗結果,幾何平均值為0.194ng/ml,FDA就此規定該值為EC-2的1個內毒素單位,EC-2的量值為5EU/ng。自1982年美國藥典修訂1980年(20)版首次收載的細菌內毒素試驗,內毒素單位(EU)被正式引入,明確指出美國內毒素參考標準品每瓶含10000EU。1EU與1個內毒素國際單位(IU)相當。USP版ng跟EU通過RSE/CSE的比率進行轉化。其比率附在COA證書中。CSE與所使用的鱟試劑一一對應。

6檢測

細菌內毒素是革蘭氏陰性菌的細胞壁成分,當細菌死亡或自溶后便會釋放出內毒素。因此,細菌內毒素廣泛存在於自然界中。如自來水中含內毒素的量為1至100EU/ml。當內毒素通過消化道進入人體時並不產生危害,但內毒素通過注射等方式進入血液時則會引起不同的疾病。內毒素小量入血后被肝臟枯否細胞滅活,不造成機體損害。內毒素大量進入血液就會引起發熱反應—「熱原反應」。因此,生物製品類、注射用藥劑、化學藥品類、放射性藥物、抗生素類、疫苗類、透析液等製劑以及醫療器材類(如一次性注射器,植入性生物材料)必須經過細菌內毒素檢測試驗合格后才能使用。由於家兔對熱原的反應與人基本相似,所以半個世紀以來用家兔來檢測熱原,為保障藥品質量和用藥安全發揮了重要作用。
1956年美國人Bang發現美洲鱟血液遇革蘭氏陰性菌時會產生凝膠。其後Levin和Bang又搞清楚微量革蘭氏陰性菌內毒素也可以引起凝膠反應,從而創立了鱟試劑檢測法。由於鱟試劑法簡單﹑快速﹑靈敏﹑準確,已廣泛用於臨床、製藥工業藥品檢驗等方面。
在美國,鱟試驗被稱作為「細菌內毒素試驗(Bacterial Endotoxin Test)收載於1980年20版美國藥典。隨後英、德、意、日以及中國相繼在藥典中收載了這一檢查法。此後鱟試驗逐漸替代家兔熱原試驗,但由於部分藥品由於自身特殊性無法通過稀釋法消除干擾,因此鱟試驗還無法完全取代家兔熱原試驗。2005年版中國藥典規定168個品種進行細菌內毒素檢查法,並收錄了2種細菌內毒素檢查法:包括凝膠法和光度測定法兩種方法。前者利用鱟試劑與細菌內毒素產生凝集反應的原理來定性檢測或半定量內毒素,後者包括濁度法和顯色基質(比色)法,系分別利用鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化及產生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團的多少來定量測定內毒素。比色法又可分為終點顯(比)色法和動態比色法。該方法靈敏度、精密度高。國內如廈門鱟試劑廠早在05年即有顯色基質(終點顯色)鱟試劑盒上市。
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