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聚丙醯胺凝膠電泳

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聚丙醯胺凝膠電泳
來源:互聯網作者:未知發布時間:2006-12-16

聚丙醯胺凝膠電泳

中性聚丙烯醯胺凝膠電泳

安裝電泳裝置和配製凝膠溶液

1.必要時可用KOH/甲醇清洗玻璃板和間隔片。

2.用溫熱的去污劑溶液洗滌玻璃板和間隔片,再充分漂洗,先用自來水,再用去離子水。應拿取玻璃的邊緣部分或帶手套操作,以免手上的油脂殘留在玻璃板的工作面上。用乙醇沖洗玻璃板,並將其置於一邊晾乾。

3.(可做可不做)其中一塊玻璃板的一面用硅化液處理(如Sigmacote或Acrylease):在化學通風廚內,將玻璃板放於一疊紙巾上,倒少量硅化液於其表面上,用Kimwipes紙巾塗抹均勻,然後用去離子水沖洗、紙巾擦乾。

4.安裝玻璃與間隔片:

a.將較大的(不帶凹口)玻璃板平放在實驗台上,在玻璃板的兩側將間隔片平行置於其邊緣放妥。

b.用凡士林輕塗以助於間隔片在後面的操作中保持原位。

c.將內板(帶凹口的玻璃板)在間隔片上放妥。

d.用夾子或鐵皮製紙夾將玻璃板加在一起,將整塊玻璃的兩邊及底部用凝膠密封帶封緊,形成不透水密封。

5.根據玻璃板的大小和間隔片的厚度計算所需凝膠的體積。

6.(可做可不做)將所需用量的聚丙烯醯胺:亞甲雙丙烯醯溶液放於一乾淨的帶側臂的燒瓶中,加入磁力攪拌子,抽真空脫氣。開始脫氣應溫和一些,並邊脫氣邊旋轉燒瓶直至不再有氣泡溢出為止。

 

灌制凝膠

7.下面的操作需要戴手套,在托盤上進行,以免濺出的丙烯醯胺:亞甲雙丙烯醯溶液灑在實驗台上。動作應迅速,於丙烯醯胺聚合前完成。

a.每100ml丙烯醯胺:亞甲雙丙烯醯溶液中加入35μlTEMED,輕輕旋轉混勻溶液。

b.用50ml注射器吸取凝膠溶液,調轉注射器,排凈進入針管的空氣。將注射器的針頭插入兩塊玻璃板之間的空隙,注入丙烯醯胺溶液,幾乎注滿改空隙。

c.將玻璃板斜靠在試管架上,與實驗檯面成約10°角。

8.立即將合適的梳子插到凝膠中,小心勿使梳齒下留有泡。梳子的頂端應略高於玻璃板的上沿。用鐵皮製紙夾將梳子夾緊,使其就位。必要時,用剩餘的丙烯醯胺溶液完全充滿模具。確認無丙烯醯胺溶液從模具漏出。

9.丙烯醯胺於室溫聚合30~60min。若凝膠回縮明顯,應補加丙烯醯胺:亞甲雙丙烯醯溶液。

10.聚合完全后,用1×tbe浸潤的紙巾包繞梳子和凝膠的頂部。然後用SaranWrap模密封整塊凝膠,4℃保存,直至使用。

11.當準備好進行電泳時,在梳子的周圍及其頂部噴些1×TBE緩衝液,從聚合的凝膠中小心取出梳子。用注射器吸取1×TBE沖洗加樣孔。用剃鬚刀或解剖刀除去凝膠底部的密封膠帶。

 

上樣與電泳

12.將凝膠放入電泳槽中,用大號鐵皮製夾子夾住其邊緣或用裝置本身的夾子固定。帶凹口的玻璃板應面對緩衝液槽向裡面放置。

13.用配製凝膠溶液同一批次的5×TBE配製電泳緩衝液灌滿緩衝液槽。用一根彎頭巴斯德吸管或注射針頭排除藏匿於凝膠底部的氣泡。

14.用巴斯德吸管或注射器再次吸取1×TBE沖洗加樣孔。將DNA樣品與適量6×凝膠載樣緩衝液混合,用Hamilton注射器或帶有拉長的塑料吸頭的微量移液管加入加樣孔。

15.將電極與電源相連(正極接下槽),打開電源,進行電泳。

16.電泳至標準參照染料遷移至所需位置。關閉電源,拔掉插頭,棄去電泳槽中的電泳緩衝液。

17.卸下玻璃板,用解剖刀或剃鬚刀片除去凝膠密封膠帶。將玻璃板放在實驗台上(硅化的玻璃板在上面)。用間隔片或塑料楔將上面的玻璃板的一角翹起。檢查一下凝膠仍應附著在下面玻璃板上。將上面的玻璃板平穩的移開,去掉間隔片。

18.用染色檢測或放射自顯影檢測檢測聚丙烯醯胺凝膠中的DNA條帶的位置。

 

 

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