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腺苷酸環化酶

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1腺苷酸環化酶

腺苷酸環化酶體系
多肽、蛋白質類及兒茶酚胺激素如腎上腺素、胰高血糖素、胰島素、促腎上腺皮質素、促甲狀腺素等都是通過這一信息傳遞而發揮作用的。腺苷酸環化酶廣泛分佈於哺乳動物的細胞膜中,此酶催化ATP生成cAMP並釋放焦磷酸。
激素和相應的膜受體結合后,經G蛋白的中介激活腺苷酸環化酶。激素受體嵌在細胞膜的脂雙層內,它與激素結合的部位面向細胞外側。腺苷酸環化酶也居質膜中,位於細胞內側。
G蛋白位於細胞質膜胞漿面的一種外周蛋白,由3個亞基Gα、Gβ及Gγ,由於α亞基結構和作用不同,可分為激動型G蛋白抑制型G蛋白兩類。
激動型 G蛋白(Gs)未被激活前,Gγ系與GDP結合,呈無活性狀態,一旦受體與激素結合后,即可誘發G蛋白上的Gα-GDP 與GTP交換,成為活性狀態的Gα-GTP 。同時,Gα-GTP即與Gβγ部分分離,並移動到鄰近的βγ腺苷酸環化酶部位,以激活腺苷酸環化酶,後者催化ATP變成cAMP。但Gα-GTP的壽命是短暫的,因為Gα本身具有GTP酶的活性,可以水解GTP為GDP與Pi。又成無活性的Gα-GDP,並返回與Gβγ結合成完整的無活性的G蛋白(a-βγ)-GDP。
另有一類G蛋白抑制型G蛋白(Gi),會抑制I,V,和VI亞型的AC的活性例如胰島素、生長素抑制素通過Gi使細胞內cAMP濃度下降。但Gi對II和IV型則有正向刺激作用。
另外,Ca離子跟鈣調蛋白(calmodulin)也可以激活ACI型與III和VIII型。

2腺苷酸環化酶的電鏡酶細胞化學實驗方法

腺苷酸環化酶主要分佈於細胞質膜、核膜和內質網膜上。它也是一種磷酸酶,能催化ATP形成3',5'-環磷酸腺苷(cAMP)並釋放出焦磷酸。Howell等人(1972)首先用亞胺二磷酸腺苷(AMP-PNP)作底物,成功地對動物細胞中的腺苷酸環化酶進行了定位。現已確認,在未固定和固定的組織中,ATP-PNP是腺苷酸環化酶的專一性底物,在腺苷酸環化酶的作用下,能生成cAMP和PNP,後者與捕捉鉛離子反應,生成一種不溶性的電子密度很高的產物。但鉛能在一定程度上抑制酶活性,為克服這一缺點, Fujiomto等(1981)設計了使用二鉀亞碸(DMSO)的硝酸鉛法。下面介紹的是Fujimoto等人使用的DMSO的硝酸鉛法。
固定:配製固定液的緩衝液使用0.1M pH為7.4的二甲胂酸鈉緩衝液,內含8%蔗糖、5%的DMSO。
固定液配方: 2%多聚甲醛和0.25%戊二醛混合液。對於肝臟來說,1%以上的戊二醛固定時,可導致明顯的酶失活。但若加5%的DMSO,酶活性能較好保存。總體來說,多聚甲醛與戊二醛的濃度應因組織而異。一般在0~4℃固定2小時或室溫固定1小時。
洗滌:用配製固定液相同的緩衝液漂洗1小時~過夜,期間更換緩衝液數次;而後進行厚切片;
孵育:配方及條件見\ref{table:Enzyme-7},
作為腺苷酸環化酶特異底物的AMP-PNP在室溫中或長期冷凍保存時,ATP、AMP-PN 和AMP-PNP-P等化合物容易增多,應引起注意。左旋咪唑的加入是由於底物AMP-PNP 容易受到組織的鹼性磷酸酶分解,加入左旋咪唑能抑制該酶的活性,在鹼性磷酸酶活性高的組織內,左旋咪唑的濃度等因素需特別注意考慮。氟化鈉為腺苷酸環化酶的激活劑,應根據組織不同進行前處理后,將氟化鈉加入到孵育液中。
后固定:后固定前,必須用不含DMSO的二甲胂酸鈉緩衝液進行充分洗滌。
殘存的DMSO可以與鋨酸反應,產生擴散性的微細顆粒。后固定用二甲胂酸鈉緩衝液配製的1%~2%的鋨酸。鋨酸后固定時對酶反應產物有一定的影響,有人認為固定時間不應超過10min,超過後可引起酶反應產物顆粒變粗變大、擴散,有時由於全部溶出而導致完全沒有反應產物的陰性結果。因此認為用鋨酸固定時間最好控制在5分鐘內。也有用2~4%的戊二醛代替鋨酸進行后固定。
對照實驗中可除去底物AMP-PNP,也可在對照實驗的孵育液中加入5mM的四氧嘧啶。
DMSO的硝酸鉛法孵育液配方及條件table:Enzyme-7
孵育液配方:& Tris-順丁烯二酸緩衝液(pH 7.4) 80mM
蔗糖 8%
氟化 20mM
茶鹼 2.0mM
AMP-PNP 0.5mM
硫酸鎂 4.0mM
左旋咪唑 2.5mM
DMSO 5%(V/V)
硝酸鉛 2.0mM
孵育條件: 孵育液pH 7.4
孵育溫度 37℃
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