標籤:實驗物理化學工具分析學色譜學

色譜柱由柱管、壓帽、卡套(密封環)、篩板(濾片)、接頭、螺絲等組成。

1簡介

chromatographic column
裝填有固定相用以分離混合組分的柱管。
多為金屬或玻璃製作。有直管形、盤管形、U形管等形狀。
色譜柱可分為填充柱和開管柱兩大類。液相色譜通常均採用填充柱。
色譜柱的分離效果取決於所選擇的固定相,以及色譜柱的製備和操作條件。
色譜是一種分離分析手段,分離是核心,因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好,分析速度快等。市售的用於HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球(包括離子交換樹脂)、多孔碳等,其粒度一般為3,5,7,10μm等,柱效理論值可達5~16萬/米。對於一般的分析只需5000塔板數的柱效;對於同系物分析,只要500即可;對於較難分離物質對則可採用高達2萬的柱子,因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足複雜混合物分析的需要。
柱效受柱內外因素影響,為使色譜柱達到最佳效率,除柱外死體積要小外,還要有合理的柱結構(儘可能減少填充床以外的死體積)及裝填技術。即使最好的裝填技術,在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的,靠近管壁的部位比較疏鬆,易產生溝流,流速較快,影響沖洗劑的流形,使譜帶加寬,這就是管壁效應。這種管壁區大約是從管壁向內算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統中,柱外效應對柱效的影響遠遠大於管壁效應。

2構造

色譜柱由柱管、壓帽、卡套(密封環)、篩板(濾片)、接頭、螺絲等組成。柱管多用不鏽鋼製成,壓力不高於70 kg/cm2 時,也可採用厚壁玻璃或石英管,管內壁要求有很高的光潔度。為提高柱效,減小管壁效應,不鏽鋼柱內壁多經過拋光。也有人在不鏽鋼柱內壁塗敷氟塑料以提高內壁的光潔度,其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯裡的,用於細管柱。色譜柱兩端的柱接頭內裝有篩板,是燒結不鏽鋼或鈦合金,孔徑0.2~20µm(5~10µm),取決於填料粒度,目的是防止填料漏出。
色譜柱按用途可分為分析型和製備型兩類,尺寸規格也不同:①常規分析柱(常量柱),內徑2~5mm(常用4.6mm,國內有4mm和5mm),柱長10~30cm;②窄徑柱(narrow bore,又稱細管徑柱、半微柱semi-microcolumn),內徑1~2mm,柱長10~20cm;③毛細管柱(又稱微柱microcolumn),內徑0.2~0.5mm;④半製備柱,內徑>5mm;⑤實驗室製備柱,內徑20~40mm,柱長10~30cm;⑥生產製備柱內徑可達幾十厘米。柱內徑一般是根據柱長、填料粒徑和摺合流速來確定,目的是為了避免管壁效應。

3填料

常見的分配柱填料:碳十八柱(ODS/C18)、碳八柱(MOS/C8)、碳六柱(Hexyl/C6)、
碳四柱(Butyl/C4)、碳一柱(Methyl/C1)、陰離子交換柱(SAX)、
陽離子交換柱(SCX)、苯基柱(Phenyl)、氨基柱(Amino/NH2)、
氰基柱(Cyano/CN/Nitrile)
常見的吸附柱填料:硅膠柱

4分類

流動相
1、在進行樣品檢測前,至少使用20倍柱體積流動相使色譜柱充分平衡。流動相一定要使用色譜級別的溶劑。如使用水相的緩衝液應當天配製以保持新鮮避免細菌產生。
2、流動相使用前需用微孔濾膜過濾,消除流動相中顆粒對色譜系統和色譜柱的損壞。緩衝液與其他流動相混合后應重新過濾避免溶解度變化造成產生新的沉澱。不應使用純水作為流動相衝洗C18色譜柱,以免柱性能損壞(添加5%的有機溶劑沖洗色譜柱,同時可以達到對緩衝鹽清洗的作用。還可以使色譜柱更容易平衡)。
3、流動相需脫氣后使用,可避免因氣泡導致的泵和檢測器的工作不正常。如果測試時使用的流動相與色譜柱保存使用的流動相有較大區別,應該使用過度分佈的形式進行平衡。避免由於流動相的突然變化造成柱壓增加過大或流動相緩衝鹽結晶造成對色譜柱和儀器系統的損壞。正相色譜柱比反相色譜柱需要更長的平衡時間。
保存操作
1、如果流動相含有酸或無機鹽,應當先用去離子水(20倍柱體積)沖洗乾淨。然後用用100%乙腈或甲醇保存色譜柱。最後用柱子的接頭密封,並放在穩定的環境中存放。
2、應避免色譜柱受到直接的機械衝擊或摔落,避免造成色譜柱性能的降低。
色譜柱的再生:
用相當於20倍柱體積的溶劑按下列順序沖洗柱子,建議按柱子的箭頭方向沖洗,儘可能不反衝。沖洗時使用的的參考溶劑順序是水、甲醇、氯仿、異丙醇。

5發展方向

因強調分析速度而發展出短柱,柱長3~10cm,填料粒徑2~3µm。為提高分析靈敏度,與質譜(MS)聯接,而發展出窄徑柱、毛細管柱和內徑小於0.2mm的微徑柱(microbore)。細管徑柱的優點是:①節省流動相;②靈敏度增加;③樣品量少;④能使用長柱達到高分離度;⑤容易控制柱溫;⑥易於實現LC-MS聯用。
但由於柱體積越來越小,柱外效應的影響就更加顯著,需要更小池體積的檢測器(甚至採用柱上檢測),更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設備應具備如下性能:輸液泵能精密輸出1~100µl/min的低流量,進樣閥能準確、重複地進樣微小體積的樣品。且因上樣量小,要求高靈敏度的檢測器,電化學檢測器和質譜儀在這方面具有突出優點。

6性能評價

色譜柱的性能除了與固定相性能有關外,還與填充技術有關。在正常條件下,填料粒度>20&micro;m時,干法填充製備柱較為合適;顆粒<20&micro;m時,濕法填充較為理想。填充方法一般有4種:①高壓勻漿法,多用於分析柱和小規模製備柱的填充;②徑向加壓法,Waters專利;③軸向加壓法,主要用於裝填大直徑柱;④干法。柱填充的技術性很強,大多數實驗室使用已填充好的商品柱。
必須指出,高效液相色譜柱的獲得,裝填技術是重要環節,但根本問題還在於填料本身性能的優劣,以及配套的色譜儀系統的的結構是否合理。
無論是自己裝填的還是購買的色譜柱,使用前都要對其性能進行考察,使用期間或放置一段時間后也要重新檢查。柱性能指標包括在一定實驗條件下(樣品、流動相、流速、溫度)下的柱壓、理論塔板高度和塔板數、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重複性,或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重複性在±5%或±10%以內。進行柱效比較時,還要注意柱外效應是否有變化。
一份合格的色譜柱評價報告應給出柱的基本參數,如柱長、內徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。

7注意事項

色譜柱的正確使用和維護十分重要,稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中,需要注意下列問題,以維護色譜柱。
① 避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會衝動柱內填料,因此在調節流速時應該緩慢進行,在閥進樣時閥的轉動不能過緩(如前所述)。
② 應逐漸改變溶劑的組成,特別是反相色譜中,不應直接從有機溶劑改變為全部是水,反之亦然。
③ 一般說來色譜柱不能反衝,只有生產者指明該柱可以反衝時,才可以反衝除去留在柱頭的雜質。否則反衝會迅速降低柱效。
④ 選擇使用適宜的流動相(尤其是pH),以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接一預柱,分析柱是鍵合硅膠時,預柱為硅膠,可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠「飽和」,避免分析柱中的硅膠基質被溶解。
⑤ 避免將基質複雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內,需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經常更換。
⑥ 經常用強溶劑沖洗色譜柱,清除保留在柱內的雜質。在進行清洗時,對流路系統中流動相的置換應以相混溶的溶劑逐漸過渡,每種流動相的體積應是柱體積的20倍左右,即常規分析需要50~75ml。
下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序,作為參考:硅膠柱以正已烷(或庚烷)、二氯甲烷和甲醇依次沖洗,然後再以相反順序依次沖洗,所有溶劑都必須嚴格脫水。甲醇能洗去殘留的強極性雜質,已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷(或氯仿)依次沖洗,再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動相不含緩衝液,那麼可以省略最後用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質,在甲醇(乙腈)沖洗時重複注射100~200&micro;l四氫呋喃數次有助於除去強疏水性雜質。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時也注射二甲亞碸數次。此外,用乙腈、丙酮和三氟醋酸(0.1%)梯度洗脫能除去蛋白質污染。
陽離子交換柱可用稀酸緩衝液沖洗,陰離子交換柱可用稀鹼緩衝液沖洗,除去交換性能強的鹽,然後用水、甲醇、二氯甲烷(除去吸附在固定相表面的有機物)、甲醇、水依次沖洗。
⑦ 保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇,柱接頭要擰緊,防止溶劑揮發乾燥。絕對禁止將緩衝溶液留在柱內靜置過夜或更長時間。
⑧ 色譜柱使用過程中,如果壓力升高,一種可能是燒結濾片被堵塞,這時應更換濾片或將其取出進行清洗;另一種可能是大分子進入柱內,使柱頭被污染;如果柱效降低或色譜峰變形,則可能柱頭出現塌陷,死體積增大。
在後兩種情況發生時,小心擰開柱接頭,用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度(注意把被污染填料取凈)再把柱內填料整平。然後用適當溶劑濕潤的固定相(與柱內相同)填滿色譜柱,壓平,再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到改善,但是很難恢復到新柱的水平。
柱子失效通常是柱端部分,在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱(5~30mm),可以起到保護、延長柱壽命的作用。採用保護柱會損失一定的柱效,這是值得的。
通常色譜柱壽命在正確使用時可達2年以上。以硅膠為基質的填料,只能在pH2~9範圍內使用。柱子使用一段時間后,可能有一些吸附作用強的物質保留於柱頂,特別是一些有色物質更易看清被吸著在柱頂的填料上。新的色譜柱在使用一段時間后柱頂填料可能塌陷,使柱效下降,這時也可補加填料使柱效恢復。
每次工作完后,最好用洗脫能力強的洗脫液沖洗,例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。當採用鹽緩衝溶液作流動相時,使用完后應用無鹽流動相衝洗。含鹵族元素(氟、氯、溴)的化合物可能會腐蝕不鏽鋼管道,不宜長期與之接觸。裝在HPLC儀上柱子如不經常使用,應每隔4~5天開機沖洗15分鐘。

8新進展

一、石墨化碳填料
硅膠的化學穩定性較差,僅能在pH=2~8的環境下工作。但是,在很多場合下,需要使用極端的pH條件。為此,人們曾大力發展高分子微球、氧化鋁、氧化鋯等化學穩定性更好的基質材料。但是,很難有一種材料能全面地滿足液相色譜基質的要求。例如,高分子微球在有機溶劑中會發生一些溶脹,因此難以應用於以含有機溶劑的流動相進行梯度淋洗的場合;氧化鋁和氧化鋯與硅膠相比,雖然化學穩定性較好,但其表面修飾與鍵合比較困難。因此,化學穩定性好的碳材料便很自然地被考慮作為色譜填料的基質。
碳材料有極好的化學穩定性,可耐受寬達pH=1~14的環境;耐高溫,石墨化碳可耐3000℃以上的高溫而不受破壞;經適當加工的碳材料可具有很好的機械強度,具有優良的導電性、導熱性及電磁屏蔽特性。更為難能可貴的是,多孔性碳材料以其結構的特點而具有很好的吸附性及選擇性。正是碳材料的這些特性,使人們期待它在色譜領域中能有特殊的用途。
二、貫流色譜填料
貫流色譜是20世紀80年代末至90年代初發展起來的一種色譜分離新方法。在這種填料上,既有通常的微孔或大孔,例如50~150nm的微孔,又有貫穿整個顆粒的,孔徑約600~800nm超大孔存在。這種貫穿的大孔,可以允許流動相直接進入填料顆粒的內部並貫穿而過。這樣,就相當於極大地降低了填料顆粒的直徑,即以貫穿孔將填料分割成了很多更細小的顆粒,在這種小顆粒上的微孔已經短到不對傳質過程構成明顯的阻力。因此,在這種貫流色譜填料上,傳質阻力已經非常小。同時,貫穿孔內流動相的線速度正比於柱子中流動相的速度,即傳質過程已由擴散傳質變為對流傳質。這就意味著,在一定範圍內,及時提高流動相速度,也不會降低柱子的分離效率。由於填料上同時還存在有通常的多孔結構,其比表面積並未隨貫穿孔的出現而大幅度降低。
因此,在這種填料上的樣品負載量也不隨流速的增加而減少。再者,填料上600~800nm的貫穿孔,極大地增加了柱子的通透性,使得這種柱子即使工作於很高的流速下,其操作壓力也不需要很高。所以,這種貫流色譜柱可以同時具有高流速、高效率、高樣品負載量和低操作壓力的特點。
三、整體柱
整體柱又稱整體固定相、棒柱、連續床等,是在柱管內原位聚合或固定化了的連續整體多孔結構,可根據需要對整體材料的表面作相應的衍生化,是一種新型的用於分離分析或作為反應器的多孔介質。通過控制聚合條件來得到具有理想孔徑分佈的整體柱。整體柱中的空間由聚合物顆粒中的孔和顆粒間的縫隙組成,分離在樣品流經孔結構時發生。可以減少路徑的差異和縱向擴展。
整體柱的優點包括:可以原位製備,省去製備填料和裝柱,也可以同法製成聚合物顆粒后再裝柱;聚合物易於製備,柱子的長度和直徑在一定程度上不受限制;聚合反應混合物中的單體可以靈活選擇以得到適合的基質和性質;易於在柱衍生化,以得到具有合適性質的色譜柱;通過控制聚合反應的條件可以優化孔的性狀。
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