標籤:微生物細菌檢驗

用藥敏實驗進行藥物敏感度的測定,以便準確有效的利用藥物進行治療。但由於葯敏試驗要求比較嚴格,條件比較高,僅僅在大中專院校或科研單位有條件的可以操作,一些養殖廠或一些門診難有條件進行葯敏試驗的操作。針對這個問題,農業部動物檢疫所青島易邦生物工程有限公司動物疫病診療中心經過幾年的總結和實踐,逐漸總結出幾套適合基層進行葯敏試驗的操作方法。目前,臨床微生物實驗室進行葯敏試驗的方法主要有紙片擴散法,稀釋法(包括瓊脂和肉湯稀釋法),抗生素濃度梯度法(E-test法),和自動化儀器等。

1簡介

體外抗菌藥物敏感性試驗簡稱葯敏試驗(AST),是指在體外測定藥物抑菌或殺菌能力的試驗。
根據美國國家臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)近期推薦的標準,對非苛氧菌(腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌、和其他非腸科桿菌、葡萄球菌屬細菌、腸球菌屬細菌)和苛氧菌(嗜血桿菌屬細菌、淋病奈瑟菌、肺炎鏈球菌和其他鏈球菌)選擇常規葯敏試驗的首選藥物(A 組抗生素)或臨床使用的主要抗生素(B組抗生素)進行葯敏試驗。
抗菌葯對細菌性傳染病的控制起到了非常重要的作用,但由於養殖過程中不科學的、盲目的濫用抗菌葯,很多致病性細菌產生了耐藥性,使得抗菌葯對細菌性疾病的控制效果越來越差,不但造成藥物浪費,而且還延誤病情,給養殖戶造成了很大的經濟損失。
隨著新型致病菌的不斷出現,抗菌葯的防治效果越來越差。並且各種致病菌對不同的抗菌藥物的敏感性不同,同一細菌的不同菌株對不同抗菌藥物的敏感性也有差異。長期以來,各種致病菌耐藥性的產生使各種常用抗菌藥物往往失去藥效,以及不能很好的掌握藥物對細菌的敏感度,所以一個正確的結果,可供臨床醫師選用抗菌藥物的參考,並提高療效。農業部動物檢疫所青島易邦生物工程有限公司動物疫病診療中心總結出幾套適合基層進行葯敏試驗的操作方法,現簡單介紹如下。

2分類

稀釋法
稀釋法葯敏試驗可用於定量測試抗菌藥物對某一細菌的體外活性,分為瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。實驗時,抗菌藥物的濃度通常經過倍比(lg2)稀釋,能抑制待測菌肉眼可見生長的最低藥物濃度成為最小抑菌濃度(MIC),一個特定抗菌藥物的測試濃度範圍應該包含能夠檢測細菌的解釋性折點(敏感、中介和耐葯)的濃度,同時也應該包含質控參考菌株的MIC.
2.1 瓊脂稀釋法 首先製備含抗菌藥物的瓊脂稀釋平板。再接種待測菌株,然後是結果判讀。
2.2 肉湯稀釋法
自動化儀器法

3實驗步驟

實驗準備
2.1 葯敏片的準備:購買或自製
2.1.1 製備方法:取新華1號定性濾紙,用打孔機打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔乾燥的青霉素空瓶中,瓶口以單層牛皮紙包紮。經15磅15-20分鐘高壓消毒后,放在37℃溫箱或烘箱中數天,使完全乾燥。
2.1.2 抗菌葯紙片製作:在上述含有50片紙片的青霉素瓶內加入藥液0.25毫升,並翻動紙片,使各紙片充分浸透藥液,翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄藥物名稱,放37℃溫箱內過夜,乾燥后即密蓋,如有條件可真空乾燥。切勿受潮,置陰暗乾燥處存放,有效期3-6個月。
2.2 藥液的製備(用於商品葯的試驗):按商品葯的使用治療量的比例配製藥液;如商品葯百病消按其說明量治療量0.01%飲水,可按這個比例配製藥液,可取10毫克加入10毫升的水中混勻。此稀釋液即為用於做葯敏試驗的藥液。
培養基
細菌葯敏試驗所用的培養基種類較多,多數情況下,採用WHO組織統一要求的M—H培養基,這種培養基中含有的低胸腺嘧啶是與磺胺類藥物競爭的物質,因此進行的葯敏試驗效果較好。此外,還有適量的Ca、Mg,在培養基中起到觸媒的作用。但是,有些細菌對培養基中的成分有特殊的要求,特殊的菌要用特殊的培養基才能進行葯敏試驗。例如,流感嗜血桿菌的葯敏試驗培養基用HTM瓊脂;淋球菌的葯敏試驗培養基用加5%羊血的巧克力M—H瓊脂;肺炎鏈球菌的葯敏實驗用M—H瓊脂加5%的脫纖維羊血培養基。培養基中還有適量的Ca、Mg,在培養基中起到溶酶的作用,其含量的變化,可影響氨基糖苷類和四環素對銅綠假單胞菌的試驗結果,含量過高,抑菌圈會變小,含量過低,抑菌圈會大得不可接受。
細菌葯敏試驗的培養基厚度大約為4mm,若培養基厚度大於4mm,會使細菌出現耐葯;若小於4mm,本應耐葯的易出現敏感。所以,試驗時一定不要把葯敏紙片放在中央部位,而應均勻地排布在平皿周圍的培養基上。製作葯敏試驗的培養基用水,主要是Ca、Mg、A1等礦物質離子,也在很大程度上影響著葯敏試驗的結果。
細菌
由於各種菌對藥物的敏感性不同,產生的抑菌環大小不同,如果菌種不純,試驗中所產生的抑菌環大小與該菌種在純培養狀態下產生的抑菌環大小存在較大的差異,影響判斷結果的準確性。因此需要對各種致病菌提純后,分別進行不同的葯敏試驗。葯敏試驗時,需要將提純后的菌種配製成一定濃度的菌液。WHO組織制定的標準是要求菌液濃度在1.5億/ml 左右。若菌液濃度過高,該菌會對所有藥物產生耐葯;反之,菌液濃度過低,該菌會對所有藥物均敏感。最精確的方法是使用分光光度計測定新鮮培養物菌懸液的吸光度,來確定菌液濃度。國家細菌耐藥性監測網的三級甲等醫院,其微生物實驗室大多數用此法來確定葯敏試驗的菌液濃度。
葯敏試驗中要將菌液均勻地塗在培養基上,使細菌均勻分佈,這樣才能使試驗結果不會出現較大的偏差。塗菌后15min才能貼葯敏紙片。由於塗菌后,細菌要有一段時間的適應過程,但是時間不能過長,否則會使細菌產生耐葯。貼葯敏紙片時,每取一種葯敏紙片必須燒一下鑷子口,避免葯敏紙片之間相互混淆,以提高葯敏的準確性。藥物殺滅細菌存在一定的量比,葯敏試驗培養基上細菌層越厚抑菌圈就越小,反之抑菌圈就越大。根據一種藥物抑菌圈的有無或者大小,只能判斷出該葯對細菌有沒有效果,但其敏感性的高低需要通過科學嚴謹的實驗來確定。藥物的敏感程度需要根據葯敏試驗的結果,並結合以上因素做綜合分析,才能得出科學的結論,而片面地根據葯敏圈的大小來決定敏感與否,結果不夠準確。

培養時間

一般培養溫度和時間為37℃ 8-18小時,有些抗菌葯擴散慢如多粘菌素,可將已放好抗菌葯的平板培養基,先置4℃冰箱內2~4小時,使抗菌葯預擴散,然後再放37℃溫箱中培養,可以推遲細菌的生長,而得到較大的抑菌圈。

4應用

藥物敏感實驗后,應選擇高敏藥物進行治療,也可選用兩種藥物協助使用,以減少耐葯菌株。在選擇高敏藥物時應考慮藥物的吸收途徑,因為我們葯敏實驗是藥液直接和細菌接觸,而在給禽用藥的時候,必須通過機體的吸收才能使藥物達到一定的效果,所以在給禽用藥時,高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法,這樣才會達到好的治療效果。
上一篇[埃塞爾雷德二世]    下一篇 [乳酸桿菌]

相關評論

同義詞:暫無同義詞