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蔗糖密度梯度離心

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用蔗糖密度梯度離心法進行了禽腦脊髓炎病毒的純化,為了研究高等植物細胞質膜上的質子泵ATP酶的作用機理,需要純化細胞質膜,Hodges等首先使用蔗糖梯度法純化燕麥根細胞質膜,現在廣泛地應用著,Lundborg等應用水溶性多聚體(PEG/Dextran)兩相分配法純化小麥根細胞質膜后,兩相分配法在質膜純化上逐步引人注意,被認為是一種優於蔗糖梯度法的方法,Lundborg等用兩相分配法分。

1 蔗糖密度梯度離心 -簡介

蔗糖密度梯度離心蔗糖密度梯度離心

蔗糖密度梯度離心,將禽腦脊髓炎病毒(AEV)L2Z株、Van Roekel株和1143株分別經卵黃囊接種6日齡SPF雞胚,接毒后,以4500r/min離心及胰腺,用玻璃勻漿器製成10%的組織懸液。組織懸液經3次反覆凍融后,以4500r/min離心15min,取上清液。而後用氯仿處理,取水相,經冷凍真空濃縮,進行不連續蔗糖密度梯度離心。取出含AEV的組分,用PBS稀后超速離心除去蔗糖。亦稱平衡密度梯度離心法。用超離心機對小分子物質溶液,長時間加一個離心力場達到沉降平衡,在沉降池內從液面到底部出現一定的密度梯度。若在該溶液里加入少量大分子溶液,則溶液內比溶劑密度大的部分就產生大分子沉降,比溶劑密度小的部分就會上浮,最後在重力和浮力平衡的位置,集聚形成大分子帶狀物。

利用這種現象,測定核酸或蛋白質等的浮遊密度,或根據其差別進行分析的一種沉降平衡法。自1958年米西爾遜(M.Meselson),斯塔爾(F.W.Stahl),維諾格拉德(J.Vinograd)成功地分離了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA以來,該法取得許多成果。為得到必要的濃度梯度,多採用濃氯化銫溶液,所以有時也使用氯化銫濃度梯度離心法這個名稱,還可採用氯化銣、溴化銫等溶液。通常利用分析超離心機,但在將細胞顆粒成分進行分離等以純化為目的的情況,利用密度差,使用分離超離心機,採用預先製備好的蔗糖等的密度梯度。〔2〕採用蔗糖等一些小分子溶液,預先在分離超離心機的樣品地內製備出密度梯度,在其上面再加上一層少量的大分子溶液后,離心,大分子就形成層狀而沉降。若含有沉降係數不同的許多成分,就會出現許多層。這種情況採用適當的編排號碼,取出樣品池內的溶液,然後進行研究。

2 蔗糖密度梯度離心 -應用方法

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純化病毒常用的方法是蔗糖密度梯度離心法,能得到比較純的病毒。其過程如下:

1、將收集的組織或臟器或其他,用玻璃勻漿器充分研磨后製成懸液,經反覆凍融3 次后,置- 20 ℃冰箱中,備用。

2、先以5000g離心15分鐘后,獲取上清夜,然後再20000g高速離心30分鐘后取上清夜。

3、接著10萬g超速離心2h,將沉澱用少量STE溶解。

4、先在超速離心管中加入5-8mL的第3步所獲取的含病毒樣品的溶解液,然後在離心管中依次加入30 % , 45 % , 60 %的蔗糖,加的時候是用長針頭從底部往上加的。11萬g離心2.5h,發現在30 %與45 % 以及45 % 與60 %之間都有一條明亮的帶,用長針頭將兩條不同部位的帶都吸取出來,分別收集到不同的瓶內。

5、去蔗糖;用STE緩衝液適量稀釋純化的病毒,然後11萬g離心3h,用少量STE(根據沉澱的量決定加入多少)緩衝液把沉澱懸起,即最後獲得了純化的病毒。-20度凍純備用,用時可用分光光度計測定其病毒含量。

3 蔗糖密度梯度離心 -產品用途

用蔗糖密度梯度離心法,進行了禽腦脊髓炎病毒的純化。將禽腦脊髓炎病毒(AEV)L2Z株、Van Roekel株和1143株分別經卵黃囊接種6日齡SPF雞胚,接毒后13天,收集腦、消化道及胰腺,用玻璃勻漿器製成10%的組織懸液。組織懸液經3次反覆凍融后,以4500r/min離心15min,取上清液。而後用氯仿處理,取水相,經冷凍真空濃縮,進行不連續蔗糖密度梯度離心。取出含AEV的組分,用PBS稀。后超速離心除去蔗糖,得到提純的病毒,病毒樣品經2%磷鎢酸負染,於電鏡下觀察可見典型的病毒粒子,大小為24---28nm。

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