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蛋白質分離純化

標籤:下游技術

1簡介

蛋白質分離純化是用生物工程下游技術從混合物之當中分離純化出所需要得目的蛋白質的方法。
是當代生物產業當中的核心技術。該技術難度、成本均高;例如一個生物藥品的成本75%都花在下游蛋白質分離純化當中。

2常用技術

1、沉澱,
2、電泳:蛋白質在高於或低於其等電點的溶液中是帶電的,在電場中能向電場的正極或負極移動。根據支撐物不同,有薄膜電泳、凝膠電泳等。
3、透析:利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。
4、層析:
a.離子交換層析,利用蛋白質的兩性遊離性質,在某一特定PH時,各蛋白質的電荷量及性質不同,故可以通過離子交換層析得以分離。如陰離子交換層析,含負電量小的蛋白質首先被洗脫下來。
b.分子篩,又稱凝膠過濾。小分子蛋白質進入孔內,滯留時間長,大分子蛋白質不能同時入孔內而徑直流出。
5、超速離心:既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。不同蛋白質其密度與形態各不相同而分開。

3蛋白質分離純化技術

吸附層析
1、吸附柱層析
吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相,以有機溶劑或緩衝液為流動相構成柱的一種層析方法。
2、薄層層析
薄層層析是以塗佈於玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相,以液體為流動相的一種層析方法。這種層析方法是把吸附劑等物質塗佈於載體上形成薄層,然後按紙層析操作進行展層。
3、聚醯胺薄膜層析
聚醯胺對極性物質的吸附作用是由於它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚醯胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時,展層劑與被分離物在聚醯胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離在聚醯胺膜表面發生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續過程,就能導致分離物質達到分離目的。
凝膠過濾
凝膠過濾又叫分子篩層析,其原因是凝膠具有網狀結構,小分子物質能進入其內部,而大分子物質卻被排除在外部。當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時,溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。
聚焦層析
聚焦層析也是一種柱層析。因此,它和另外的層析一樣,照例具有流動相,其流動相為多緩衝劑,固定相為多緩衝交換劑。
聚焦層析原理可以從pH梯度溶液的形成、蛋白質的行為和聚焦效應三方面來闡述。
1、PH梯度溶液的形成
在離子交換層析中,pH梯度溶液的形成是靠梯度混合儀實現的。例如,當使用陰離子交換劑進行層析時,製備pH由高到低呈線性變化的梯度溶液的方法是,在梯度儀的混合室中裝高pH溶液,而在另一室裝低pH極限溶液,然後打開層析柱的下端出口,讓洗脫液連續不斷地流過柱體。這時從柱的上部到下部溶液的pH值是由高到低變化的。而在聚焦層析中,當洗脫液流進多緩衝交換劑時,由於交換劑帶具有緩衝能力的電荷基團,故pH梯度溶液可以自動形成。例如,當柱中裝陰離子交換劑PBE94(作固定相)時,先用起始緩衝液平衡到pH9,再用含pH6的多緩衝劑物質(作流動相)的淋洗液通過柱體,這時多緩衝劑中酸性最強的組分與鹼性陰離子交換對結合發生中和作用。隨著淋洗液的不斷加入,柱內每點的pH值從高到低逐漸下降。照此處理J段時間,從層析柱頂部到底部就形成了pH6~9的梯度。聚焦層析柱中的pH梯度溶液是在淋洗過程中自動形成的,但是隨著淋洗的進行,pH梯度會逐漸向下遷移,從底部流出液的pH卻由9逐漸降至6,並最後恆定於此值,這時層析柱的pH梯度也就消失了。
2、蛋白質的行為
蛋白質所帶電荷取決於它的等電點(PI)和層析柱中的pH值。當柱中的pH低於蛋白質的PI時,蛋白質帶正電荷,且不與陰離於交換劑結合。而隨著洗脫劑向前移動,固定相中的pH值是隨著淋洗時間延長而變化的。當蛋白質移動至環境pH高於其PI時,蛋白質由帶正電行變為帶負電荷,並與陰離子交換劑結合。由於洗脫劑的通過,蛋白質周圍的環境pH 再次低於PI時,它又帶正電荷,並從交換劑解吸下來。隨著洗脫液向柱底的遷移,上述過程將反覆進行,於是各種蛋白質就在各自的等電點被洗下來,從而達到了分離的目的。
不同蛋白質具有不同的等電點,它們在被離子交換劑結合以前,移動之距離是不同的,洗脫出來的先後次序是按等電點排列的。
3、聚焦效應
蛋白質按其等電點在pH梯度環境中進行排列的過程叫做聚焦效應。pH梯度的形成是聚焦效應的先決條件。如果一種蛋白質是加到已形成pH梯度的層析柱上時,由於洗脫液的連續流動,它將迅速地遷移到與它等電點相同的pH處。從此位置開始,其蛋白質將以緩慢的速度進行吸附、解吸附,直到在等電點pH時被洗出。若在此蛋白質樣品被洗出前,再加入第二份同種蛋白質樣品時,後者將在洗脫液的作用下以同樣的速度向前移動,而不被固定相吸附,直到其遷移至近似本身等電點的環境處(即第一個作品的緩慢遷移處)。然後兩份樣品以同樣的速度遷移,最後同時從柱底洗出。事實上,在聚焦層析過程中,一種樣品分次加入時,只要先加入者尚未洗出,並且有一定的時間進行聚焦,剩餘樣品還可再加到柱上,其聚焦過程都能順利完成,得到的結果也是滿意的。
高效液相色譜
高效液相色譜按其固定相的性質可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等類型。用不同類型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對應的普通液相層析的原理相似。其不同之處是高效液相色譜靈敏、快速、解析度高、重複性好,且須在色譜儀中進行。
高效液相色譜儀主要有進樣系統、輸液系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統,下面將分別敘述其各自的組成與特點。
1、進樣系統
一般採用隔膜注射進樣器或高壓進樣器完成進樣操作,進樣量是恆定的。這對提高分析樣品的重複性是有益的。
2、輸液系統
該系統包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l.47~4.4×107Pa,流速可調且穩定,當高壓流動相通過層析柱時,可降低樣品在柱中的擴散效應,可加快其在柱中的移動速度,這對提高解析度、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存和梯度儀,可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變,包括改變洗脫液的極性、離子強度、pH值,或改用競爭性抑製劑或變性劑等。這就可使各種物質(即使僅有一個基團的差別或是同分異構體)都能獲得有效分離。
3、分離系統
該系統包括色譜柱、連接管和恆溫器等。色譜柱一般長度為10~50cm(需要兩根連用時,可在二者之間加一連接管),內徑為2~5mm,由"優質不鏽鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料製成,住內裝有直徑為5~10μm粒度的固定相(由基質和固定液構成)。固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或硅膠構成,它們都有惰性(如硅膠表面的硅酸基團基本已除去)、多孔性(孔徑可達1000?)和比表面積大的特點,加之其表面經過機械塗漬(與氣相色譜中固定相的製備一樣),或者用化學法偶聯各種基團(如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體的有機化合物。因此,這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。例如,在多孔性硅膠表面偶聯豌豆凝集素(PSA)后,就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外,固定相基質粒小,柱床極易達到均勻、緻密狀態,極易降低渦流擴散效應。基質粒度小,微孔淺,樣品在微孔區內傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高解析度是有益的。根據柱效理論分析,基質粒度小,塔板理論數N就越大。這也進一步證明基質粒度小,會提高解析度的道理。
再者,高效液相色譜的恆溫器可使溫度從室溫調到60C,通過改善傳質速度,縮短分析時間,就可增加層析柱的效率。
4、檢測系統
高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。
(1)紫外檢測器
該檢測器適用於對紫外光(或可見光)有吸收性能樣品的檢測。其特點:使用面廣(如蛋白質、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用);靈敏度高(檢測下限為10-10?g/ml);線性範圍寬;對溫度和流速變化不敏感;可檢測梯度溶液洗脫的樣品。
(2)示差折光檢測器
凡具有與流動相折光率不同的樣品組分,均可使用示差折光檢測器檢測。目前,糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作簡單,但靈敏度低(檢測下限為10-7?g/ml),流動相的變化會引起折光率的變化,因此,它既不適用於痕量分析,也不適用於梯度洗脫樣品的檢測。
(3)熒光檢測器
凡具有熒光的物質,在一定條件下,其發射光的熒光強度與物質的濃度成正比。因此,這一檢測器只適用於具有熒光的有機化合物(如多環芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等)的測定,其靈敏度很高(檢測下限為10-12~10-14?g/ml),痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可採用。
(5)數據處理系統
該系統可對測試數據進行採集、貯存、顯示、列印和處理等操作,使樣品的分離、製備或鑒定工作能正確開展。

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