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血小板生成素

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血小板生成素(Thromboietin TPO)又名巨核細胞生長因子(MegakaryocyteGrowthandDevelopmentMGDF)由332氨基酸組成的糖蛋白。TPO產生部位主要為腎臟(亦有證據表明TPO產生部位主要為肝臟)。TPO是一種激素調節因子,它的分泌受外周血小板數量的影響,與血小板計數呈負相關。


1 血小板生成素 -基本概況

血小板是止血的一個必要成分。它是由骨髓和脾臟的多功能幹細胞分化的巨核細胞(megakaryocyte,MK)產生的。通常患癌症接受化療或骨髓移植的病人的血小板水平恢復非常緩慢,會有因大出血而死亡的危險。因此,尋找可以加速血小板再生的血細胞生長因子就顯得十分緊迫了。

早期研究認為血小板缺乏症動物血漿中存在一種活性物質,它可以通過增加骨髓中巨核細胞的大小和數量來調節外周血小板水平,並將之命名為血小板生成素(thrombopoietin,TPO)。

70年代以來,許多研究人員著手嘗試從一系列生物來源中純化和檢測TPO的工作。但由於起始材料的專一性低和生物分析過程過於繁瑣,TPO一直沒能得到明確的鑒定。直到1990年,Sougri等發現了c-mpl原癌基因,才使克隆TPO成為可能。

2 血小板生成素 -生物學作用

(1)生理調節造血祖細胞演化成成熟巨核細胞增殖和分化;

(2)與EPO一起相互協調,共同刺激原核細胞和紅細胞的生成;共同促進骨髓抑制療法后血小板和紅細胞的恢復;

(3)TPO作為Mpl受體的配體,可防止血小板減少而不增加血栓閉塞併發症的危險。國外最新文獻報道:急性白血病、骨髓增生異常綜合症(MDS)、肝硬化、特發性血小板減少性紫癜患者TPO水平降低;再障患者TPO水平明顯升高。根據免疫競爭原理,用平衡法直接檢測血清TPO水平的放射免疫分析方法。

3 血小板生成素 -TPO基因的克隆及其蛋白結構

c-mpl原癌基因最早是在鼠轉導的骨髓增生白血病病毒(MPLV)中發現的,其所編碼的c-Mpl是造血生長因子受體超家族的一個新成員,它在小鼠的脾、骨髓和胎肝以及人的巨核細胞、血小板和巨核細胞前體CD34+細胞上限制性表達,與紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)受體家族具有同源性。c-mplmRNA的反義寡脫氧核苷酸與CD34+細胞作用,可選擇性抑制巨核細胞集落的形成而不影響其他細胞系集落的形成,表明Mpl是調節巨核細胞生成的細胞因子的細胞表面受體。

Wending等證明,在血小板減少的血漿中,所有巨核細胞集落刺激因子活性和能使血小板增加的活性均可由重組的c-Mpl清除,可見這些生物活性都歸功於c-Mpl配體。進一步實驗表明,重組的c-Mpl配體可在鼠中較其他已知的細胞生長因子大大地提高血小板水平,同時還可以刺激巨核細胞的形成。因此,可以確定,c-Mpl配體就是人們所努力尋找的TPO。

1994年,deSauvage等利用c-Mpl親和柱從經放射處理的患再生障礙性貧血的豬的血漿(aplasticporcineplasma,APP)中提純到Mpl配體,即TPO,利用其氨基酸序列信息從人的胎肝的cDNA文庫中分離到人的TPOcDNA。

Foster等利用鼠的TPOcDNA為探針,從人類基因庫中分離到一個編碼人類TPO的基因,這個基因約為6kb大小,由6個外顯子和5個內含子組成,並與EPO基因具有相似結構。通過中期染色體製備物的原位雜交將此基因定位在染色體3q26-27上。

人類TPOcDNA全長為1774bp,包括一個1059bp的開放讀碼框架(ORF),編碼一個由353個氨基酸殘基構成的前體多肽,ORF的5』端和3』端非編碼區分別為215bp和498bp,還有一個Poly(A)+尾巴。

人的TPO蛋白前體N端為21個氨基酸殘基組成的信號肽,經水解后形成332個氨基酸殘基組成的成熟TPO蛋白,分子量約為38kD。成熟的TPO蛋白含兩個完全不同的結構域。一個是153個氨基酸殘基組成的氨基末端結構域,與EPO、α-干擾素和β-干擾素同源,在人類和鼠中具高度保守性。與EPO一樣,TPO在此區中也含有4個Cys,其中3個具有保守性,第一個和最後一個Cys組成一個二硫鍵,是維持TPO和EPO生物活性所必需的。對全長人TPO蛋白與僅由N端153個氨基酸殘基組成的多肽進行生物活性對比,發現兩者具有相似的生物活性,表明TPO蛋白的生物活性主要由其N端結構域決定。另一個結構域是178個氨基酸殘基組成的羧基末端結構域,富含Ser、Thr和Pro,並具有6個(鼠中7個)潛在的糖基化位點,此區具有廣泛的種屬特異性,此區的功能可能與穩定和增加循環中的TPO的半衰期有關。在這兩個結構域之間存在一個潛在的Arg-Arg分裂位點,可能是蛋白質分子被切割加工的位點,暗示332個氨基酸殘基組成的TPO可能仍是一個蛋白前體,需經有限蛋白水解產生成熟的配體。

4 血小板生成素 -生物學特性

TPO是細胞分裂素的一種,是一種血漿糖蛋白。大量實驗證明,TPO可影響巨核細胞的增殖和成熟並釋放血小板進入血液,是循環中調節血小板水平的主要生理因子。重組TPO還被證明可以有力地刺激造血前體細胞,導致它們增殖和分化為巨核細胞集落。

Lok等每天給小鼠腹腔內注射50ng的純化重組TPO,7天後,循環中血小板數比對照組增加4倍,骨髓和脾中的巨核細胞數也大大增加。

Kaushansky等將不含成熟巨核細胞的骨髓細胞接種於含TPO的無血清的培養液中生長6天,與對照組比較,TPO誘導的巨核細胞體積更大、數量更多,細胞內核酸含量也大大增加,且趨於釋放血小板。每天100ng高純度的TPO作用於造血前體細胞可使骨髓和脾臟的巨核系祖細胞(CFG-MK)增加20倍,而每天10μgIL-6或3μgIL-11作用5~7天最多只能使之提高3倍。

研究認為,TPO的刺激作用是通過與巨核細胞上的TPO受體Mpl結合,激活了細胞上的JAK/STAT通路,誘導包括Jak2、Stat5蛋白在內的多種蛋白的酪氨酸磷酸化,從而活化巨核細胞,促使其增殖和分化產生血小板,達到提高循環中血小板水平的目的。有實驗證明,TPO還可以誘導人類血小板上的Stat3和Stat5酪氨酸磷酸化。

5 血小板生成素 -.產生與調控

RNA印跡分析表明,人TPOmRNA在胎肝和成人肝臟以及腎臟有表達。肝和腎可能是TPO的主要產生部位。

Sungaran等利用原位雜交檢測了人類腎、肝、骨髓及脾中的TPOmRNA含量。分析表明,在正常人的骨髓中雜交信號很弱,而在患血小板減少症的個體骨髓基質細胞中有大量的TPOmRNA表達。在具有正常血小板數的個體中,位於腎小管近端的細胞中TPOmRNA有持續的表達,而腎小管遠端細胞則無。在肝細胞中可測到強烈的雜交信號。而在脾中,即使是血小板減少症的個體,雜交信號也很弱。在所有的個體中,肝和脾的間質細胞和內皮細胞、腎小管外周細胞和骨髓的造血前體細胞都無TPOmRNA表達。這個結果表明人骨髓中TPOmRNA的表達可能是由血小板的數量來調節。Cohen-Solar等更證明,不僅血小板數量而且巨核細胞數量也對調節循環中的TPO水平起一定作用,TPOmRNA的量與血小板量成反比。

6 血小板生成素 -應用前景

TPO主要的臨床應用就是作為血小板減少症的治療藥物,特別是那些因化療和放療而導致的血小板減少症。

目前,對血小板減少症的臨床治療手段主要是血小板輸入法。這種方法雖可以暫時減少出血事故,但必須經常性輸入,費用龐大,而且還存在其他限制:儲存的血小板的壽命短,有通過血液傳染其它疾病的危險,以及異體免疫等問題。一般多次輸血后,近70%的病人會對輸入的血小板產生抗體,使以後的輸血效率大大減小。

而近來重組TPO在動物體內的實驗表明,它不僅能比其它造血因子更有效地增加血小板水平,還具有促進其它造血細胞系活力的能力。Grossman等分別用TPO(90μg/kg)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)(250μg/kg)、TPO+G-CSF對骨髓抑制的鼠進行皮下注射,測定治療后血小板、紅細胞以及中性白細胞的數量。通過與對照組比較,證明TPO、G-CSF單獨特別是共同作用可以大大縮短以上3種細胞生成的時間,同時也可加快骨髓、紅細胞系以及巨核前體細胞的恢復。Borge等也證實,TPO不僅能在體內外刺激巨核前體細胞的生長發育,增加其多倍性,還可以有效地促進骨髓前體細胞Lin-Sca-1+前體的活性,使其後代不僅具有生成巨核細胞的潛力,而且能生成為其它骨髓細胞系。

可見,TPO將會大大減少化療和骨髓移植的危險,有效治療血小板減少症以及其它可能的相關病症。TPO將有廣闊的應用前景。

7 血小板生成素 -參考資料

1、http://www.sinoukbio.com/show.asp?pro_id=445

2、http://www.fx120.net/yxlw/jcyx/xbfzswx/200607191417115061.htm

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