標籤:分子生物學技術 基因工程 DNA克隆

質粒載體 即,在由限制性核酸內切酶修飾過的質粒DNA序列中插入外源的目的基因,以質粒為載體,將目的基因通過轉化或轉導的方法導進宿主細胞,進行重組、篩選、擴增的過程。

1簡介

質粒是小型環狀DNA分子,在基因工程中作為最常用,最簡單的載體,必須包括三部分:遺傳標記基因,複製區,目的基因。 質粒在所有的細菌類群中都可發現,它們是獨立於細菌染色體外自我複製的DNA分子。自然界中,質粒是在營養充足時出現的,它在結構、大小、複製方式,每個細菌的拷貝數,在不同的細菌體內的繁殖力,在菌種之間的轉移力等方面都會變化,可能最重要的是質粒所攜帶的特徵的改變。大多數原核生物的質粒是雙鏈環狀的DNA分子;但是無論是在革蘭式陽性還是陰性菌體內都可以發現線狀質粒。質粒大小變化很大,可從幾個到數百個kb。質粒依靠宿主細胞提供的蛋白質進行複製,但也可以使宿主細胞獲得質粒編碼的功能。質粒複製可以與細菌的細胞周期同步,導致菌體內質粒的拷貝數較低,質粒複製也可獨立於細胞周期,使每個菌體內擴增了成百上千個質粒拷貝。一些質粒在菌種間可自由地轉移它們的DNA分子,另一些只轉移質粒給同種細菌,而有些卻根本不轉移它們的DNA。質粒帶有具有許多功能的基因,這些功能包括對抗生素和重金屬道德抗性、對誘變原的敏感性、對噬菌體的易感或抗性、產生限制酶、產生稀有的氨基酸和毒素、決定毒力、降解複雜有機分子,以及形成共生關係的能力和在生物界內轉移DNA的能力。

2基本特徵

質粒(plasmid)是細菌或細胞染色質以外的,能自主複製的,與細菌或細胞共生的遺傳成分。其特點如下:
是染色質外的雙鏈共價閉合環形DNA
covalently closed circular DNA,cccDNA),可自然形成超螺旋結構,不同質粒大小在2-300kb之間,<15kb的小質粒比較容易分離純化,>15kb的大質粒則不易提取。
質粒載體
能自主複製,是能獨立複製的複製子
autonomous replicon)。一般質粒DNA複製的質粒可隨宿主細胞分裂而傳給後代。按質粒複製的調控及其拷貝數可分兩類:嚴緊控制(stringent control)型質粒的複製常與宿主的繁殖偶聯,拷貝數較少,每個細胞中只有1個到十幾個拷貝;另一類是鬆弛控制(relaxed control)型質粒,其複製宿主不偶聯,每個細胞中有幾十到幾百個拷貝。每個質粒DNA上都有複製的起點,只有ori能被宿主細胞複製蛋白質識別的質粒才能在該種細胞中複製,不同質粒複製控制狀況主要與複製起點的序列結構相關。有的質粒的可以整合到宿主細胞染色質DNA中,隨宿主DNA複製,稱為附加體,例如細菌的性質粒就是一種附加體,它可以質粒形式存在,也能整合入細菌的DNA,又能從細菌染色質DNA上切下來。F因子攜帶基因編碼的蛋白質能使兩個細菌間形成纖毛狀細管連接的接合(conjugation),通過這細管遺傳物質可在兩個細菌間傳遞。
質粒對宿主生存並不是必需的
這點不同於線粒體,線粒體DNA也是環狀雙鏈分子,也有獨立複製的調控,但線粒體的功能是細胞生存所必需的。線粒體是細胞的一部分,質粒也往往有其表型,其表現不是宿主生存所必需的,但也不妨礙宿主的生存。某些質粒攜帶的基因功能有利於宿主細胞的特定條件下生存,例如,細菌中許多天然的質粒帶有抗藥性基因,如編碼合成能分解破壞四環素、氯黴素、氨芐表黴素等的酶基因,這種質粒稱為抗藥性質粒,又稱R質粒,帶有R質粒的細菌就能在相應的抗生素存在生存繁殖。所以質粒對宿主不是寄生的,而是共生的。醫學上遇到許多細菌的抗藥性,常與R質粒在細菌間的傳播有關,F質粒就能促使這種傳遞。
分子生物學使用的質粒載體都已不是原來細菌或細胞中天然存在的質粒,而是經過了許多的人工的改造。從不同的實驗目的出發,人們設計了各種不同的類型的質粒載體,發展很快,新的有特定用途的質粒不斷被創建。圖20-2給出最常用的大腸桿菌克隆用質粒pUC19的圖譜,此質粒的複製起點處序列經過改造,能高頻率起動質粒複製,使一個細菌pUC19的拷貝數可達500-700個;質粒攜帶一個抗氨芐青霉素基因,編碼能水解β-內醯胺環,從而破壞氨芐青霉素的酶,當用pUC19轉化細菌後放入含氨芐青霉素的培養基中,凡不含pUC19者都不能生長,結果長出的細菌就是都含有pUC19的;pUC19還攜帶細菌lac操縱元中的lacI和lacZ基因編碼,β-半乳糖苷酶N端狀146個氨基酸的段落,當培養基中含有誘導物IPTG和Xgal時,lacz ' 基因被誘導表達產生的β-半乳糖苷酶N端肽與宿主菌表達的C端肽互補而具有β-半乳糖苷酶活性(質粒和宿主編碼的肽段各自都沒有酶活性,兩都融為一體而具酶活性,稱為α-互補,α-complementation),半乳糖苷酶水解Xgal而使菌落呈現藍色;在lacz '中間又插入了一段人工設計合成的DNA序列,其中密集多個常用的限制性核酸內切酶的位點,使外來的基因和序列能很方便地被插入此位置,當外來序列插入后則破壞了lacz '編碼的半乳糖苷酶活性,生長的菌落就呈白色,這種顏色標誌的變化就很容易區分和挑選含有和不含有插入序列或基因的轉化菌落,稱為藍白篩選法。
除常用的大腸桿菌質粒載體外,還發展了許多人工構建的其它能用於微生物、酵母、植物等的質粒載體。含有不止一個ori、能攜帶插入序列在不同種類宿主細胞中繁殖的載體稱為穿梭載體(shuttle vectors)。

4分類

按複製形式
分為嚴緊型和鬆弛型複製。
根據質粒DNA複製與宿主之間的關係或在宿主細胞的拷貝數的多少,可以將質粒分為兩種不同的複製類型:嚴緊型和鬆弛型。嚴緊型質粒複製受宿主染色體DNA複製的嚴格控制,拷貝數較小一般只有1~3個拷貝。疏鬆型質粒的複製宿主的控制比較松,在宿主中的拷貝數比較多,一般有10~200個拷貝,有時可達到700個。
按基因轉移性
分兩類:(1)傳遞性質粒:常為大型、嚴緊型質粒;
(2)非傳遞性質粒:多為小型、鬆弛型質粒。
按遺傳性狀、產物分類
(1)抗生素抗性:如氨苄西林、氯黴素抗性;
(2)限制酶-修飾酶(R-M)系統:如hsdR-菌株可使DNA甲基化,但不限制外源DNA;hsd-菌株為限制和甲基化雙缺陷型。
人工構建的質粒載體分類
高拷貝數的質粒載體
ColE1、pMB1派生質粒具有高拷貝數的特點。適合大量增殖克隆基因,或需要大量表達的基因產物。
低拷貝數的質粒載體
由 pSC101派生來的載體特點是分子量小的拷貝數。它有特殊的用途:當有些被克隆的基因的表達產物過多時會嚴重影響寄主菌的正常代謝活動,導致寄主菌的死亡時,就需要低拷貝的載體。
失控的質粒載體
這是一類溫度敏感型複製控制質粒。如pBEU1、 pBEU2。
插入失活型克隆載體。載體的克隆位點位於其某一個選擇性標記基因內部。如pDF41、pDF42。
正選擇的質粒載體
直接選擇轉化后的細胞。只有帶有選擇標記基因的轉化菌細胞才能在選擇培養基上生長。

5篩選特徵

選擇質粒載體的要素是要了解可用到的載體的特徵和預測重組克隆所用於的實驗。
所有的質粒載體都有三個共同的特徵:一個複製子、一個選擇性標誌和一個克隆位點。複製子是含有DNA複製起始位點的一段DNA(ori),也包括表達由質粒編碼的複製必需的RNA和蛋白質的基因。選擇性標誌對於質粒在細胞內持續存在時必不可少的。克隆位點是限制性內切酶切割位點,外源性DNA可由此插入質粒內,而且並不影響質粒的複製能力,或為宿主提供選擇性表型。
選擇性標誌:編碼抗生素抗性的基因對質粒載體來說是最普遍的細菌選擇性標誌(如pBR322);主要的抗生素選擇基因有:氨苄青霉素,氯黴素,四環素和卡那黴素四種。轉化的宿主菌一般都是抗生素敏感型的,獲得質粒后,它能在有抗生素的平板上生長,從而達到篩選的要求。另一個顯性的選擇標誌就是對λ噬菌體感染的免疫(也就是λ阻抑物)。有時也會用的一些隱性標誌,如leuB-(亮氨酸存在時就不能生長)。

6多位點

如今的載體都含有一多克隆位點(Multiple cloning site, MCS)或多位點接頭[包含約20個串聯排列的限制性內切核酸酶位點(如pUC19)]這些位點在載體內通常是獨一無二的,這樣就可以防止插入片段插入不恰當的位置,如載體其他的特徵導致破裂的位點。多克隆位點的存在可以確保載體合適大部分的DNA片段,可以針對插入片段提供特定的酶切位點圖譜,在質粒重組操作方面具有更大的靈活性。在選擇質粒載體時既要考慮在多接頭處出現的是何位點,又要考慮到這個位點的順序,因為必須確保特定的位點存在於多接頭裡。

7載體大小

大的質粒(大於15kb)不會很好轉化而且DNA產量通常很低。在設計實驗時要考慮到加入插入片段的最終載體大小,盡量用更小的載體。
兼容性
當多於一個質粒載體必須同時存在於同一個細菌細胞中,這兩個質粒的複製子必須是兼容的。當他們不能穩定地共存時,則認為這兩個質粒是不兼容的。
選擇/檢測插入片段:
為了鑒別質粒中是否含有插入片段,對一些載體進行了工程改造,這樣產生的多位點接頭的分離會引起可見的表型。例如:lacZ基因的應用(多位點接頭的分離會引用白細胞的生長而抑制藍細胞的生長,如pU19)和cccdB基因(調控細胞死亡)的應用(分離會促進細胞存活)。
參考資料:
質粒載體的定向克隆

  質粒載體的定向克隆

質粒裁體

質粒裁體

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