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酶聯免疫吸附劑測定

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1 酶聯免疫吸附劑測定 -定義

  enzyme linked immunosorbent assay,ELISA
  指將可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上,進行免疫反應的定性和定量方法。

2 酶聯免疫吸附劑測定 -基本原理

  1971年Engvall和Perlmann發表了酶聯免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)用於IgG定量測定的文章,使得1966年開始用於抗原定位的酶標抗體技術發展成液體標本中微量物質的測定方法。這一方法的基本原理是:①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面,並保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體,這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在測定時,把受檢標本(測定其中的抗體或抗原)和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體複合物與其他物質分開,最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后,底物被酶催化變為有色產物,產物的量與標本中受檢物質的量直接相關,故可根據顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。由於酶的催化效率很高,故可極大地放大反應效果,從而使測定方法達到很高的敏感度。

3 酶聯免疫吸附劑測定 -ELISA的操作要點:

  優質的試劑,良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結果準確可靠的必要條件。ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異,國內醫學檢驗一般均用板式點。
  一、標本的採取和保存
  可用作ELISA測定的標本十分廣泛,體液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、糞便)等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標本可直接進行測定(如血清、尿液),有些則需經預處理(如糞便和某些分泌物)。大部分ELISA檢測均以血清為標本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外,其他成份均同等於血清。製備血漿標本需藉助於抗凝劑,而血清標本只要待血清自然凝固、血塊收縮后即可取得。除特殊情況外,在醫學檢驗中均以血清作為檢測標本。在ELISA中血漿和血清可同等應用。血清標本可按常規方法採集,應注意避免溶血,紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質,以HRP為標記的ELISA測定中,溶血標本可能會增加非特異性顯色。
  血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染,菌體中可能含有內源性HRP,也會產生假陽性反應。如在冰箱中保存過久,其中的可發生聚合,在間接法ELISA中可使本底加深。一般說來,在5天內測定的血清標本可放置於4℃,超過一周測定的需低溫冰存。凍結血清融解后,蛋白質局部濃縮,分佈不均,應充分混勻宜輕緩,避免氣泡,可上下顛倒混和,不要在混勻器上強烈振蕩。混濁或有沉澱的血清標本應先離心或過濾,澄清后再檢測。反覆凍融會使抗體效價跌落,所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測,宜少量分裝冰存。保存血清自採集時就應注意無菌操作,也可加入適當防腐劑。
  二、試劑的準備
  按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水,包括用於洗滌的,應為新鮮的和高質量的。自配的緩衝液應用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。
  三、加樣
  在ELISA中一般有3次加樣步聚,即加標本,加酶結合物,加底物。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,並注意不可濺出,不可產生氣泡。加標本一般用微量加樣器,按規定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴,以免發生交叉污染,也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定(如間接法ELISA)需用稀釋的血清,可在試管中按規定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液,再在其中加入血清標本,然後在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器,使加液過程迅速完成。
  四、保溫
  在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應,即加標本和加酶結合物后。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間,這一保溫過程稱為溫育,有人稱之為孵育,在ELISA中似不恰當。
  ELISA屬固相免疫測定,抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法為例,加入板孔中的標本,其中的抗原並不是都有均等的和固相抗結合的機會,只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程,因此需經擴散才能達到反應的終點。在其後加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什麼ELISA反應總是需要一定時間的溫育。
  溫育常採用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃(冰箱溫度)等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度,也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應動力學研究時,實驗表明,兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時,產物的生成可達頂峰。為加速反應,可提高反應的溫度,有些試驗在43℃進行,但不宜採用更高的溫度。抗原抗體反應4℃更為徹底,在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜,以形成最多的沉澱。但因所需時間太長,在ELISA中一般不予採用。
  保溫的方式除有的ELISA儀器附有特製的電熱塊外,一般均採用水浴,可將ELISA板置於水浴箱中,ELISA板底應貼著水面,使溫度迅速平衡。為避免蒸發,板上應加蓋,也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔,此時可讓反應板漂浮在水面上。若用保溫箱,ELISA板應放在濕盒內,濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等,在盒底墊濕的紗布,最後將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規定的溫度,特別是在氣溫較低的時候更應如此。無論是水浴還是濕盒溫育,反應板均不宜疊放,以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應,操作時的室溫應嚴格限制在規定的範圍內,標準室溫溫度是指20-25℃,但具體操作時可根據說明書的要求控制溫育。室溫溫育時,ELISA板只要平置於操作台上。

4 酶聯免疫吸附劑測定 -方法類型和操作步驟

  ELISA可用於測定抗原,也可用於測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑:①固相的抗原或抗體,②酶標記的抗原或抗體,③酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件,可設計出各種不同類型的檢測方法。
  一、雙抗體夾心法
  雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法,操作步驟如下:
  ⑴將特異性抗體與固相載體連接,形成固相抗體:洗滌除去未結合的抗體及雜質。
  ⑵加受檢標本:使之與固相抗體接觸反應一段時間,讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合,形成固相抗原複合物。洗滌除去其他未結合的物質。
  ⑶加酶標抗體:使固相免疫複合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
  ⑷加底物:夾心式複合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
  根據同樣原理,將大分子抗原分別製備固相抗原和酶標抗原結合物,即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。
  二、雙位點一步法
  在雙抗體夾心法測定抗原時,如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體,則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步(圖15-5)。這種雙位點一步不但簡化了操作,縮短了反應時間,如應用高親和力的單克隆抗體,測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
  在一步法測定中,應注意鉤狀效應(hookeffect),類同於沉澱反應中抗原過剩的后帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時,過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合,而不再形成夾心複合物,所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。
  三、間接法測抗體
  間接法是檢測抗體最常用的方法,其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體,故稱為間接法。操作步驟如下:
  ⑴將特異性抗原與固相載體連接,形成固相抗原:洗滌除去未結合的抗原及雜質。
  ⑵加稀釋的受檢血清:其中的特異抗體與抗原結合,形成固相抗原抗體複合物。經洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合,在洗滌過程中被洗去。
  ⑶加酶標抗抗體:與固相複合物中的抗體結合,從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌后,固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體,可用酶標羊抗人IgG抗體。
  ⑷加底物顯色:顏色深度代表標本中受檢抗體的量。
  本法只要更換不同的固相抗原,可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。
  四、競爭法
  競爭法可用於測定抗原,也可用於測定抗體。以測定抗原為例,受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合,因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下:
  ⑴將特異抗體與固相載體連接,形成固相抗體。洗滌。
  ⑵待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液,使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原,則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原,則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合,競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會,使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原,保溫后,酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。⑶加底物顯色:參考管中由於結合的酶標抗原最多,故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差,代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡,表示標本中抗原含量越多。
  五、捕獲法測IgM抗體
  血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在,後者會幹擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗體多用捕獲法,先將所有血清IgM(包括異性IgM和非特異性IgM)固定在固相上,在去除IgG后再測定特異性IgM。操作步驟如下:
  ⑴將抗人IgM抗體連接在固相載體上,形成固相抗人IgM。洗滌。
  ⑵加入稀釋的血清標本:保溫反應后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。
  ⑶加入特異性抗原試劑:它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。
  ⑷加入針對特異性的酶標抗體:使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。
  ⑸加底物顯色:如有顏色顯示,則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在,是為陽性反應。
  六、應用親和素和生物素的ELISA
  親和素是一種糖蛋白,可由蛋清中提取。分子量60kD,每個分子由4個亞基組成,可以和4個生物素分子親密結合。現在使用更多的是從鏈黴菌中提取的鏈霉和素(strepavidin)。生物素(biotin)又稱維生素H,分子量244.31,存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物,生物素-羥基琥珀亞胺酯(biotin-hydroxysuccinimide,BNHS)可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合,雖不屬免疫反應,但特異性強,親和力大,兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置,可以連接更多的生物素化的分子,形成一種類似晶格的複合體。因此把親和素和生物素與ELISA偶聯起來,就可大大提高ELISA的敏感度。
  親和素-生物素系統在ELISA中的應用有多種形式,可用於間接包被,亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素,原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合,通過親和素-生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量,而且使其結合點充分暴露。另外,在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代,然後連接親和素-酶結合物,以放大反應信號。
  ELISA 普遍用作非放射性同位素的成鍵化驗. 在這種方法中,通常標準配體是固定的,通過加入溶液相受體或蛋白質來使之成鍵. 通過加入與受體特異性反應的抗體來定量成鍵的受體,而且最初抗體的量以加入第二種能顯色的抗體測量. 第二種抗體能識別抗體的末端,在其末端的鹼性磷酸酯或過氧化物酶等與酶發生反應,從而使溶液顯色.

5 酶聯免疫吸附劑測定 -注意事項

  1.正式實驗時,應分別以陽性對照和陰性對照控制試驗條件,待測樣品應做一式二份,以保證實驗結果的準確性。有時本底較高,說明有非特異性反應,可採用羊血清,兔血清、BSA或OVA等封閉。

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