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酶聯免疫吸附試驗

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酶聯免疫吸附試驗 (以下簡稱ELISA) :是酶免疫測定技術中應用最廣的技術。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應板 ) 表面,使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行,用洗滌法將液相中的遊離成分洗除。常用的 ELISA 法有雙抗體夾心法和間接法,前者用於檢測大分子抗原,後者用於測定特異抗體。

1吸附試驗

基本原理
ELISA方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結合,此種結合不會改變抗體的免疫學特性,也不影響酶的生物學活性。此種酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發生特異性結合。滴加底物溶液后,底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型,出現顏色反應。因此,可通過底物的顏色反應來判定有無相應的免疫反應,顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應可通過ELISA檢測儀進行定量測定,這樣就將酶化學反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結合起來,使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。
辣根過氧化物酶
過氧化物酶(HRP)廣泛分佈於植物中,辣根中含量最高,從辣根中提取的稱辣根過氧化物酶(HRP),是由無色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構成的一種糖蛋白(含糖量18%),分子量約40 000,約由300個氨基酸組成,等電點為pH 3-9,催化反應的最適pH值因供氫體不同而稍有差異,一般多在pH 5左右。此酶溶於水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的最大吸收光譜分別為275nm和403nm。
酶的純度以RZ表示:RZ=OD403/OD275
純酶的RZ多在3.0以上,最高為3.4。RZ在0.6以下的酶製品為粗酶,非酶蛋白約佔 75%,不能用於標記。RZ在2.5以上者方可用於標記。HRP的作用底物為過氧化氫,催化反應時的供氫體有幾種:⑴鄰苯二胺(OPD),產物為橙色,可溶性,敏感性高,最大吸收值在490nm,可用肉眼觀察判別,容易被濃硫酸終止反應,顏色可在數小時內不改變,是目前國內ELISA中最常用的一種;⑵聯大茴香胺(OD),產物為橘黃色,最大吸收值在400nm,顏色較穩定;⑶5-氨基水楊酸(5-AS):產物為深棕色,最大吸收值在449nm,部分溶解,敏感性較差;⑷鄰聯甲苯胺(OT)產物為藍色,最大吸收值在630nm,部分溶解,不穩定,不耐酸,但反應快,顏色明顯。
標記方法
良好的酶結合物取決於兩個條件:即高效價的抗體和高活性的酶。抗體的活性和純度對製備標記抗體至關重要,因為特異性免疫反應隨抗體活性和純度的增加而增強。在酶標記過程中,抗體的活性有所降低,故需要純度高、效價高及抗原親和力強的抗體球蛋白,最好使用親和層析提純的抗體,可提高敏感性,而且可稀釋使用,減少非特異性吸附。
酶與抗體交聯,常用戊二醛法和過碘酸鹽氧化法。郭春祥建立的HRP標記抗體的改良過碘酸鈉法簡單易行,標記效果好,特別適用於實驗室的小批量製備。其標記程序為:將5μg HRP溶於0.5ml蒸餾水中,加入新鮮配製的0.06 mol/L的過碘酸鈉(NaIO4)水溶液0.5ml,混勻置4℃冰箱30分鐘 , 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml,室溫放置30分鐘后加入含5g純化抗體的水溶液1ml,混勻並裝透析袋,以0.05mol/L、pH9.5的碳酸鹽緩衝液於4℃冰箱中慢慢攪拌透析6小時(或過夜)使之結合,然後吸出,加硼氫化鈉(NaBH4)溶液(5(g/ml)0.2ml,置4℃冰箱2小時,將上述結合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液,置4℃冰箱30分鐘后離心,將所得沉澱物溶於少許0.02mol/L、pH7.4PBS中,並對之透析過夜(4℃),次日離心除去不溶物,即得到酶標抗體,用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml,進行測定后,冷凍乾燥或低溫保存。
間接ELISA
本法主要用於檢測抗體。以鴨病毒性肝炎(DVH)抗體的ELISA為例,間接ELISA的操作程序如下。
⑴ 材料
① 包被液、洗滌液、保溫液、底物液、終止液;
② DVH包被抗原、酶標抗抗體、陰性及陽性DVH參考血清;待檢鴨血清;
③ ELISA檢測儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。
⑵ 方法步驟
① 加抗原包被 → 4℃過夜,洗滌三次、拋干
② 加待檢血清 → 37℃ 2小時,洗滌三次、拋干
③ 加酶標抗體 → 37℃ 2小時,洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 30分鐘,加終止液
⑤ 用ELISA檢測儀測定OD值,並計算出P/N比值。
⑶ 結果判定 已知陽性血清與已知陰性血清的比值(P/N)≥2.1,而且已知陽性血清的OD值≥0.4;在上述條件成立的情況下,如果待檢血清與已知陰性血清的比值(P/N)≥2.1,而且待檢血清的OD值≥0.4,則判為陽性,否則判為陰性。
雙夾心ELISA
此法與雙抗體夾心ELISA的主要區別在於:它是採用酶標抗抗體檢查多種大分子抗原,它不僅不必標記每一種抗體,還可提高試驗的敏感性。此法的基本程序為:
① 加抗體(Ab-1)包被 → 4℃過夜,洗滌三次、拋干
② 加待檢抗原(Ag) → 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
③ 加用非同種動物生產的特異性抗體(Ab-2)→ 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
④ 加入酶標抗Ab-2抗體(AB-3)→ 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
⑤ 加底物液 → 37℃ 20分鐘,加終止液
⑥ 用ELISA檢測儀測定OD值。
阻斷ELISA
本法主要用於檢測型特異性抗體。該方法現已成為豬傳染性胃腸炎(TGE)、豬偽狂犬病(PR)及豬胸膜肺炎(AP)的主要檢測方法。下面以AP2型抗體的阻斷ELISA檢測法為例介紹其操作程序:
① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃過夜,洗滌三次、拋干
② 用200μl阻斷緩衝液進行封閉 → 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
③ 加工作量1:4稀釋被檢豬血清100μl → 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分鐘,洗滌三次、拋干
⑤ 加100μl工作量豬抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干
⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分鐘,加終止液
⑦ 用ELISA檢測儀測定OD值。
本試驗同時設標準陰、陽性血清對照、兔抗AP2型陽性對照、空白對照。
斑點ELISA
與常規的微量板ELISA比較,Dot-ELISA具有簡便、節省抗原等優點,而且結果可長期保存;但其也有不足,主要是在結果判定上比較主觀,特異性不夠高等。該方法的主要操作程序為:
⑴載體膜的預處理及抗原包被 取硝酸纖維素膜用蒸餾水浸泡后,稍加乾燥進行壓圈。將陰性、陽性抗原及被檢測抗原適度稀釋后加入圈中,置37℃使硝酸纖維素膜徹底乾燥。每張7cm×2.3cm的膜一般可點加40-53個樣品,每個壓圈可加抗原液1-20μl。
⑵ 封閉 將硝酸纖維素膜置於封閉液中,37℃感作15-30分鐘。封閉液多採用含有正常動物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。
⑶ 加被檢血清 可直接在抗原圈上加,也可剪下抗原圈、置於微量板孔中,再加入一定量適度稀釋的待檢血清,37℃反應一定時間,用洗滌液洗三次,每次1-3分鐘。洗滌液一般為一定濃度的PBS-Tween溶液。
⑷ 加酶標抗體,37℃反應一定時間后,用洗滌液洗三次。
⑸顯色 加入新鮮配製的底物液,37℃反應一定時間后,去掉底物液,加蒸餾水洗滌終止反應。
⑹ 結果判定 以陽性、陰險血清作為對照,膜片中央出現深棕紅色斑點者為陽性反應,否則為陰性反應。
素質因素
實驗室人員的素質主要包括五個方面:思想素質、文化素質、技術素質、心理素質、身體素質。首先應具備一個良好的思想素質,因為我們的服務對象是人,我們的道德水平直接關係到人們的健康和生命安危,如果馬馬虎虎。三心二意,難免會有差錯事故發生,我們應該熱愛專業,耐心細緻。在工作中如標本混淆、張冠李戴、報告單發錯等都有可能造成嚴重後果;其次文化素質和技術素質,我們要熟練掌握本專業的基本理論和基本技術,認真學習新理論新知識,努力提高自己的業務水平,創造一個能夠勝任本職工作的技術平台。良好的心理素質就是要勇於面對工作生活中的挫折,在繁忙工作中,有條不紊,冷靜沉著的處理有關事務。人員素質問題是影響檢驗結果的首要因素。
影響因素
1、操作前應對實驗的物理參數有充分的了解,如環境溫度(保持在18 C~25℃)、反應孵育溫度和孵育時間、洗滌的次數等,要先查看水育箱溫度,是否符合要求。
2、正確使用加樣器加樣器應垂直加入標本或試劑,避免刮擦包被板底部。加樣過程中避免液體外濺,血清殘留在反應孔壁上,加樣器吸頭要清洗乾淨,避免污染,加樣次序要與說明書一致,否則可導致結果錯誤,實驗重複性差。
3、手工洗板加洗液時衝擊力不要太大,洗滌次數不要超過說明書推薦的洗滌次數,洗液在反應孔內滯留的時間不宜太長。不要使洗液在孔間竄流,造成孔問污染,導致假陰性或假陽性。
4、要保證加液量一致 我們在使用時感覺滴瓶加液不如加樣器好,滴瓶不易控制加液量不準,造成顯色不統一,判斷錯誤。
5、顯色液量不可過多 加樣的工作環境不能處於陽光直射的環境下,加顯色系統后要避光反應,顯色液量不能過多,以免顯色過強。
6、試劑的影響因數:應選用有國家批准文號,質量靠得住的產品,不能圖便宜,忽視質量保證。試劑應妥善保存於4℃冰箱內,在使用時先平衡至室溫,不同批號的試劑組分不宜交叉使用。試劑開啟后要在一周內用完,剩餘的試劑下次用時應先檢查是否變質,,顯色劑如被污染變色將造成全部顯色,導致錯誤結果。過期的試劑不宜再用,若別無選擇,應做好雙份質控品的監測,確保結果的可靠性。

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