評論(0

醋酸纖維素薄膜電泳

標籤: 暫無標籤

1原理:

醋酸纖維薄膜電泳(cellulose acetate membrane electrophoresis)以醋酸纖維薄膜為支持物。它是纖維素的醋酸酯,由纖維素的羥基經乙醯化而製成。它溶於丙酮等有機溶液中,即可塗布成均一細密的微孔薄膜,厚度以0.1mm—0.15mm為宜。太厚吸水性差,分離效果不好;太薄則膜片缺少應有的機械強度則易碎。

2應用:

醋酸纖維薄膜電泳操作簡單、快速、廉價。已經廣泛用於血清蛋白,血紅蛋白,球蛋白,脂蛋白,糖蛋 白,甲胎蛋白,類固醇激素及同工酶等的分離分析中,儘管它的分辨力比聚丙醯胺凝膠電泳低,但它具有簡單,快速等優點。

3特點:

1.(1)醋酸纖維薄膜對蛋白質樣品吸附極少,無「拖尾」現象,染色後背景能完全脫色,各種蛋白質染色帶分離清晰,因而提高了測定的精確性。
(2)快速省時。由於醋酸纖維薄膜親水性較濾紙小,薄膜中所容納的緩衝液也較少,電滲作用小,電泳時大部分電流是由樣品傳導的,所以分離速度快,電泳時間短,一般電泳45—60min即可,加上染色,脫色,整個電泳完成僅需90min左右。
(3)靈敏度高,樣品用量少。 血清蛋白僅需2μl血清,甚至加樣體積少至0.1μl,僅含5μg蛋白樣品也可得到清晰的分離帶。臨床醫學檢驗利用這一點,檢測在病理情況下微量異常蛋白的改變。
(4)應用面廣。某些蛋白在紙上電泳不易分離,如胎兒甲種球蛋白,溶菌酶,胰島素,組蛋白等用醋酸纖維薄膜電泳能較好地分離。
(5)醋酸纖維薄膜電泳染色后,經冰乙酸,乙醇混合液或其它溶液浸泡后可製成透明的干板,有利於掃描定量及長期保存。
2、醋酸纖維薄膜電泳與聚丙烯醯胺凝膠電泳相比,操作簡單,但分離效果不太好。如血清蛋白在醋酸纖維素薄膜電泳中,只能分離出5—6條區帶,而聚丙烯醯胺凝膠電泳可分離出數10條區帶。

4補充:

根據樣品理化性質,從提高電泳速度和分辨力出發選擇緩衝液的種類,pH和離子強度。選擇好的緩衝液最好是揮發性強,對顯色或紫外光等觀察區帶沒有影響,若樣品含鹽量較高時,宜採用含鹽緩衝液。例如血清蛋白電泳可選用pH8.6的巴比妥緩衝液或硼酸緩衝液;氨基酸的分離則可選用pH7.2的磷酸鹽緩衝液等。電泳時先將濾膜剪成一定長度和寬度的紙條。在欲點樣的位置用鉛筆做上記號,點上樣品,在一定的電壓,電流下電泳一定時間,取下濾膜,進行染色。不同物質需採用不同的顯色方法,如核苷酸等物質可在紫外分析燈下觀察定位,但許多物質必須經染色劑顯色。
醋酸纖維薄膜電泳染色後區帶可剪下,溶於一定的溶劑中進行光密度測定。也可以浸於折射率為1.474的油中或其他透明液中使之透明,然後直接用光密度計測定。
它的缺點是厚度小,樣品用量很小,不適於製備。

5注意事項

1、醋酸纖維薄膜的預處理
市售醋酸纖維薄膜均為干膜片,薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的重要關鍵之一。將干膜片漂浮於電極緩衝液表面,其目的是選擇膜片厚薄及均勻度,如漂浮15s—30s時,膜片吸水不均勻,則有白斑點或條紋,這提示膜片厚薄不勻,應捨去不用,以免造成電泳後區帶扭曲,界線不清,背景脫色困難,結果難以重複。由於醋酸纖維薄膜親水性比紙小,浸泡30min以上是保證膜片上有一定量的緩衝液,並使其恢復到原來多孔的網狀結構。最好是讓漂浮於緩衝液的薄膜吸滿緩衝液后自然下沉,這樣可將膜片上聚集的小氣泡趕著走。點樣時,應將膜片表面多餘的緩衝液用濾紙吸去,以免緩衝液太多引起樣品擴散。但也不能吸得太干,太干則樣品不易進入薄膜的網孔內,而造成電泳起始點參差不齊,影響分離效果。吸水量以不幹不濕為宜。為防止指紋感染,取膜時,應戴指套或用鑷子。
2、緩衝液的選擇
醋酸纖維薄膜電泳常選用pH8.6巴比妥溶液,其濃度為0.05mol/L—0.09mol/L。選擇何種濃度與樣品及薄膜的薄厚有關。選擇時,先初步定下某一濃度,如電泳槽兩極之間的膜長度為8 cm—10cm,則需電壓25V/cm膜長,電流強度為0.4mA/cm—0.5mA/cm膜寬。當電泳達不到或超過這個值時,則應增加緩衝液濃度或進行稀釋。緩衝液濃度過低,則區帶泳動速度快,並由於擴散變寬;緩衝液濃度過高,則區帶泳動速度慢,區帶分佈過於集中不易分辨。
3、加樣量
加樣品的多少與電泳條件、樣品的性質、染色方法與檢測手段靈敏度密切相關。作為一般原則,檢測方法越靈敏,加樣量則越少,對分離更有利。如加樣量過大,則電泳後區帶分離不清楚,甚至互相干擾,染色也較費時。如電泳後用洗脫法定量時,每厘米加樣線上需加樣品0.1μl—0.5μl約相當於5μg—1000μg蛋白。血清蛋白常規電泳分離時,每厘米加樣線加樣量不超過1μl,相當於60μg—80μg的蛋白質。但糖蛋白和脂蛋白電泳時,加樣量則應多些。對每種樣品加樣量均應先作預實驗加以選擇。
點樣好壞是獲得理想圖譜的重要環節之一,以印章法加樣時,動作應輕、穩,用力不能太重,以免將薄膜弄壞或印出凹陷而影響電泳區帶分離效果。
4、電量的選擇
電泳過程應選擇合適的電流強度,一般電流強度為0.4mA/cm—0.5mA/cm寬膜為宜。電流強度高,尤其在溫度較高的環境中,可引起蛋白質變性或由於熱效應引起緩衝液中水分蒸發,使緩衝液濃度增加,造成膜片乾涸。電流過低,則樣品泳動速度慢且易擴散。
5、染色液的選擇
對醋酸纖維薄膜電泳后染色應根據樣品的特點加以選擇。其原則是染料對被分離樣品有較強的著色力,背景易脫色;應盡量採用水溶性染料,不宜選擇醇溶性染料,以免引起醋酸纖維素膜溶解。
應控制染色時間。時間長,薄膜底色深不易脫去;時間短,著色淺不宜區分,或造成條帶染色不均,必要時可進行復染。
6、透明及保存
透明液應臨用前配製,以免冰乙酸及乙醇揮發影響透明效果。這些試劑最好選用分析純。透明前,薄膜應完全乾燥。透明時間應掌握好,如在透明乙液中浸泡時間太長則薄膜溶解,太短則透明度不佳。
透明后的薄膜完全乾燥后才浸入石蠟中,使薄膜軟化。如有水,則液體石蠟不易浸入,薄膜不易平展。

相關評論

同義詞:暫無同義詞