標籤:蛋白質組學

雙向電泳(two-dimensional electrophoresis)是等電聚焦電泳和SDS-PAGE的組合,即先進行等電聚焦電泳(按照pI分離),然後再進行SDS-PAGE(按照分子大小),經染色得到的電泳圖是個二維分佈的蛋白質圖。

1研究方向

雙向電泳
蛋白質組研究的發展以雙向電泳技術作為核心. 雙向電泳由O』Farrell』s於1975年首次建立並成功地分離約1 000個E.coli蛋白,並表明蛋白質譜不是穩定的,而是隨環境而變化. 雙向電泳原理簡明,第一向進行等電聚焦,蛋白質沿pH梯度分離,至各自的等電點;隨後,再沿垂直的方向進行分子量的分離. 目前,隨著技術的飛速發展,已能分離出10 000個斑點(spot). 當雙向電泳斑點的全面分析成為現實的時候,蛋白質組的分析變得可行.
樣品製備(sample prepareation)和溶解同樣事關2-DE的成效,目標是儘可能擴大其溶解度和解聚,以提高解析度. 用化學法和機械裂解法破碎以儘可能溶解和解聚蛋白,兩者聯合有協同作用. 對IEF(isoelectric focusing)樣品的預處理涉及溶解、變性和還原來完全破壞蛋白間的相互作用,併除去如核酸等非蛋白物質. 理想的狀態是人們應一步完成蛋白的完全處理. 而離液劑2 mol/L硫脲和表面活性劑4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白從IPG(immobilized pH gradients)膠上的轉換.三丁基膦(Tributyl phosphine,TBP)取代β-巰基乙醇或DTT完全溶解鏈間或鏈內的二硫鍵,增強了蛋白的溶解度,並導致轉至第二向的增加]. 兩者通過不同的方法來增加蛋白的溶解度,作為互補試劑會更有效. 在保持樣品的完整性的前提下,可利用超離和核酸內切酶去除核酸(DNA). 除此之外,機械力被用來對蛋白分子解聚,如超聲破碎]等. 另外,添加PMSF等蛋白酶抑製劑,可保持蛋白完整性. 由於商品化的IPG膠條是乾燥脫水的,可在其水化的過程中加樣,覆蓋整個IPG膠,避免在樣品杯中的沉澱所致的樣品丟失]. 此外,低丰度蛋白(low abundance protein)在細胞內可能具有重要的調節功能,代表蛋白質組研究的「冰山之尖」,故分離低丰度蛋白是一種挑戰.亞細胞分級和蛋白質預分級、提高加樣量(已達到1~15 mg級的標準)、應用敏感性檢測,可以提高其敏感性. 如一種多肽免疫2-DE印跡(MI-2DE)是利用幾種單克隆抗體技術來分析和檢測. 提高組蛋白和核糖體蛋白等鹼性蛋白(basic proteins)的分離是另一難點. 由於鹼性pH範圍內凝膠基質的不穩定及逆向電滲流(EOF)的產生,對PI(等電點)超過10的鹼性蛋白,通過產生?0~10%?的山梨醇梯度和16%的異丙醇可減少之. 亦可用雙甲基丙烯醯胺來增加基質的穩定性.

2挑戰

2-DE面臨的挑戰是高解析度和重複性. 高解析度確保蛋白最大程度的分離,高重複性允許進行凝膠間配比(match). 對2-DE而言,有3種方法分離蛋白:1)ISO-DALT(isoelectric focus)以O』Farrell』s技術為基礎. 第一嚮應用載體兩性電解質(carrier ampholyte,CA),在管膠內建立pH梯度. 隨著聚焦時間的延長,pH梯度不穩,易產生陰極漂移. 2) NEPHGE(non-equilibrium pH gradient electrophoresis)用於分離鹼性蛋白(pH>7.0). 如果聚焦達到平衡狀態,鹼性蛋白會離開凝膠基質而丟失. 因此,在等電區域的遷移須在平衡狀態之前完成,但很難控制. 3)IPG-DALT發展於80年代早期. 由於固相pH梯度(Immobilized pH gradient,IPG)的出現解決了pH梯度不穩的問題. IPG通過immobiline共價偶聯於丙烯醯胺產生固定的pH梯度,克服了IEF的缺點,從而達到高度的重複性. 目前可以精確製作線性、漸進性和S型曲線,範圍或寬或窄的pH梯度. 新的酸性pH 3~5或鹼性pH 6~11的IPG凝膠梯度聯合商品化的pH 4~7的梯度可對蛋白質形成蛋白質組重疊群(proteomic contigs)從而有效分離.

3斑點檢測

分離后的斑點檢測(spot detection)亦很重要. 所採用的檢測策略和分離后所採用的方法的相互作用是很重要的. 此外,還需考慮反應的線性、飽和閾/動態範圍、敏感性、對細胞蛋白群的全體定量分析的適應性、可行性. 目前,沒有一種蛋白染色覆蓋廣泛的濃度和PI及分離後分析技術.銀染已成為一種檢測2-DE的流行方法,可檢測少到2~5ng的蛋白,因此較考馬斯亮藍R-250敏感. 多數糖蛋白不能被考馬斯亮藍染色,一些有機染料不適於PVDF膜.放射性標記不依賴其代謝的活性,並僅適於對合成的蛋白質檢測. 另有一種改良的2-DE(差異凝膠電泳),即應用兩種不同的染料熒游標記兩個樣品,使在同一凝膠上電泳后的凝膠圖象為兩個,避免了幾種2-DE的比較,可在納克級進行檢測.
較早期相比,2-DE有兩個主要的進步:首先,極高的重複性使有機體的參考圖譜,可通過Internet獲得,來比較不同組織類型、不同狀態的基因表達;其次,高加樣量使得2-DE成為一項真正的製備型技術.

4常見問題

重泡脹后的膠可以不用轉移到另一個電泳槽,直接跑 2D 的一向嗎?
一般情況下是可以的。但當上樣量特別大時,可能會有一部分蛋白質沒有被膠條吸收,這樣跑完 1D 和 2D 膠后,會有很多橫向條紋。所以在這種情況下,最好在重泡脹后,將膠條轉移到另外一個電泳漕中進行電泳。為什麼我在等電聚焦前加的礦物油在聚焦後會減少,暴露出了膠條的背面?
這是因為 BioRad 的電泳槽有個蓋子。為了固定電泳槽中的膠條,這個蓋子上設計了對應的突起,以便壓住膠條。由於虹吸作用,這個突起會導引礦物油到相鄰的空電泳槽,從而降低有膠條的電泳槽中的礦物油液面。如果由此把膠條暴露在空氣中,那對等電聚焦的影響將是毀滅性的。為了防止這個現象的發生,可以在相鄰的空電泳槽里,也加入適量(80 %滿)的礦物油。
跑第一向時,為什麼要設定一個電流的最大值電壓(50 μ A/ 膠)?
電流的平方和功率成正比。電流增大,功率增大,放出的熱量也隨之增大,就會導致膠條的溫度增加。當溫度超過 30 攝氏度時,緩衝液里的尿素就容易解離,產生一些極性分子,從而對等電聚焦產生影響。跑第一向時,為什麼剛開始的電壓比較低,而後逐漸增高?
剛開始時,體系內的帶電小分子比較多(比如無機鹽和雙極性分子)。所以在這個階段,電流主要是由這些小分子的移動所產生的。由於這些分子質量小,移動他們不需要很高的電壓。當這些小分子移動到他們的目的地時(無機鹽移動到極性相反的電極;兩性分子移動到對應的 pH 條帶),體系內的蛋白質才開始肩負起運載電流的任務,逐漸向所對應的 pH 區域移動。
跑第一向時,為什麼會產生一條藍色的條帶,並逐漸向酸性端移動?
藍色條帶是緩衝液中痕量的溴酚藍被聚焦所產生的。溴酚藍也是 pH 指示劑,當它移動到酸性區時(pH4),顏色會變成黃色。溴酚藍的這個移動過程大體上發生在極性小分子的聚焦之後,蛋白質大分子聚焦之前。
跑第一向時,為什麼電壓總達不到預定值?
當上樣量比較大時或體系內鹽分比較多時,聚焦的電壓有可能達不到所設定的數值。
跑第一向時,在電壓達到預定值后,電流為什麼會降低?
當上樣量比較少時,所有蛋白在較短的時間內就移動到所對應的 pH 值區域值,從而變成中性分子。這樣,體系的電阻越來越大,在恆定的電壓下,電流就會越來越小。
跑第一向時,為什麼在兩個電極絲附近有氣泡產生?
等電聚焦完成後,所有的蛋白質都移動到了相應的 pI 值區域,而成為中心分子。這是加在體系上的電壓就開始電解水分子,在陽極產生氧氣,在陰極產生氫氣。
重泡脹緩衝液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什麼,雙極性分子的作用是什麼?
硫脲的作用是增加蛋白質的溶解性,特別是鹼性蛋白的溶解性。雙極性分子的作用也是增加蛋白質的溶解性。當蛋白移動到相應的 pH 值后,就變成了中性分子。而不帶電荷的蛋白質分子容易聚集,從而降低其在隨後的二向膠時的遷移效率,可能會造成豎的脫尾。而硫脲和雙極性小分子則會鑒定中性蛋白質之間的相互作用,防止它們的聚集。
怎樣估計 2D 膠上蛋白質點的分子量和 pI 值?
可以用 BioRad 生產的 2D 膠標準蛋白來校準。也可以用體系內已知蛋白來做比對。
為什麼 2D 膠上的蛋白點有橫的和豎的脫尾?
橫的脫尾可能是:1)一向等電聚焦不完全; 2)某些蛋白質本身的原因(糖蛋白); 3)蛋白的丰度太高。豎的脫尾是因為跑二向時,蛋白的溶解度不好。
什麼成分會影響 2D 膠的效果?
核酸,鹽,去垢劑等等。
2D 膠的上樣量應該在什麼範圍?
上樣量和樣品有關。樣品內蛋白種類多的上樣量要大些,這樣每個點才有足夠的量被檢測到。一般的全細胞裂解體系,上樣量大概在 100 微克(銀染)到 500 微克(考染)之間。
我的蛋白質濃度很低,應該用什麼方法來濃縮?
蛋白質的濃縮有很多方法。大致有超濾法,沉澱法和透析法。超濾比較溫和,對蛋白質不會有修飾和改變,蛋白的種類一般不會有丟失。它的缺點是總樣品的量可能會減少(被膜所吸附)。另外超濾對樣品的要求比較高。甘油,去垢劑都會堵塞濾膜,影響超濾的效果。沉澱法比較快速,容易操作,對鹽,甘油,去垢劑的耐受性好。缺點是可能會有部分種類的蛋白沒有被沉澱下來(丟失)。沉澱法中,又以 TCA 法最為普遍使用。使用 TCA 法時,一定要用冷的純丙酮清洗蛋白沉澱兩次,去處殘留的 TCA 和其他沉澱下來的雜質。透析法只使用於量比較大的樣品,量小時,操作困難。透析法可以和超濾法聯用。先把樣品透析到一個比較乾淨的環境(不含鹽,甘油,去垢劑或其它雜質,比如碳酸氫氨溶液),然後再進行超濾。

5操作步驟

第一向等電聚焦
⒈ 從冰箱中取-20℃冷凍保存的水化上樣緩衝液(I)(不含DTT,不含Bio-Lyte)一小管(1ml/管),置室溫溶解。
⒉ 在小管中加入0.01g DTT, Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml,充分混勻。
⒊ 從小管中取出400ml水化上樣緩衝液,加入100ml樣品,充分混勻。
⒋ 從冰箱中取-20℃冷凍保存的IPG預製膠條(17cm pH 4-7),室溫中放置10分鐘。
⒌ 沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣,中間的樣品液一定要連貫。注意:不要產生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質的分佈。
⒍ 當所有的蛋白質樣品都已經加入到聚焦盤或水化盤中后,用鑷子輕輕的去除預製IPG膠條上的保護層。
⒎ 分清膠條的正負極,輕輕地將IPG膠條膠面朝下置於聚焦盤或水化盤中樣品溶液上,使得膠條的正極(標有+)對應於聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上,因為這些溶液不會被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產生氣泡。如果已經產生氣泡,用鑷子輕輕地提起膠條的一端,上下移動膠條,直到氣泡被趕到膠條以外。
⒏ 在每根膠條上覆蓋2-3ml礦物油,防止膠條水化過程中液體的蒸發。需緩慢的加入礦物油,沿著膠條,使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。
⒐ 對好正、負極,蓋上蓋子。設置等電聚焦程序。
⒑聚焦結束的膠條。立即進行平衡、第二向SDS-PAGE電泳,否則將膠條置於樣品水化盤中,-20℃冰箱保存。
第二向SDS-PAGE電泳
⒈ 配製10%的丙烯醯胺凝膠兩塊。配80ml凝膠溶液,每塊凝膠40ml,將溶液分別注入玻璃板夾層中,上部留1cm的空間,用MilliQ水(沒有milliq的話ddh2o也行,注,水雲深浪按)、乙醇或水飽和正丁醇封面,保持膠面平整。聚合30分鐘。一般凝膠與上方液體分層后,表明凝膠已基本聚合。
⒉ 待凝膠凝固后,倒去分離膠表面的MilliQ水、乙醇或水飽和正丁醇,用MilliQ水沖洗。
⒊ 從-20℃冰箱中取出的膠條,先於室溫放置10分鐘,使其溶解。
⒋ 配製膠條平衡緩衝液I。
5.在桌上先放置乾的厚濾紙,聚焦好的膠條膠面朝上放在乾的厚濾紙上。將另一份厚濾紙用MilliQ水浸濕,擠去多餘水分,然後直接置於膠條上,輕輕吸干膠條上的礦物油及多餘樣品。這可以減少凝膠染色時出現的縱條紋。
⒍ 將膠條轉移至溶漲盤中,每個槽一根膠條,在有膠條的槽中加入5ml膠條平衡緩衝液I。將樣品水化盤放在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。
⒎ 配製膠條平衡緩衝液Ⅱ。
⒏ 第一次平衡結束后,徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩衝液I。並用濾紙吸取多餘的平衡液(將膠條豎在濾紙上,以免損失蛋白或損壞凝膠表面)。再加入膠條平衡緩衝液Ⅱ,繼續在水平搖床上緩慢搖晃15分鐘。
⒐ 用濾紙吸去SDS-PAGE聚丙烯醯胺凝膠上方玻璃板間多餘的液體。將處理好的第二向凝膠放在桌面上,長玻璃板在下,短玻璃板朝上,凝膠的頂部對著自己。
⒑將瓊脂糖封膠液進行加熱溶解。
⒒將10×電泳緩衝液,用量筒稀釋10倍,成1×電泳緩衝液。趕去緩衝液表面的氣泡。
⒓第二次平衡結束后,徹底倒掉或吸掉樣品水化盤中的膠條平衡緩衝液Ⅱ。並用濾紙吸取多餘的平衡液(將膠條豎在濾紙上,以免損失蛋白或損壞凝膠表面)。
⒔將IPG膠條從樣品水化盤中移出,用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在1×電泳緩衝液中。然後將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上。其餘膠條同樣操作。
⒕將放有膠條的SDS-PAGE凝膠轉移到灌膠架上,短玻璃板一面對著自己。在凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封膠液。
⒖用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭,輕輕地將膠條向下推,使之與聚丙烯醯胺凝膠膠面完全接觸。注意不要在膠條下方產生任何氣泡。在用鑷子、壓舌板或平頭針頭推膠條時,要注意是推動凝膠背面的支撐膜,不要碰到膠面。
⒗放置5分鐘,使低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固。
⒘在低熔點瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠轉移至電泳槽中。
⒙在電泳槽加入電泳緩衝液后,接通電源,起始時用的低電流(5mA/gel/17cm)或低電壓,待樣品在完全走出IPG膠條,濃縮成一條線后,再加大電流(或電壓)(20-30mA/gel/17cm),待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時即可停止電泳。
⒚電泳結束后,輕輕撬開兩層玻璃,取出凝膠,並切角以作記號(戴手套,防止污染膠面)。
⒛進行染色。

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