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電子順磁共振

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電子順磁共振(electron paramagnanetic resonance,EPR),是由不配對電子的磁矩發源的一種磁共振技術,可用於從定性和定量方面檢測物質原子或分子中所含的不配對電子,並探索其周圍環境的結構特性。對自由基而言,軌道磁矩幾乎不起作用,總磁矩的絕大部分(99%以上)的貢獻來自電子自旋,所以電子順磁共振亦稱「電子自旋共振」(ESR)。

1 電子順磁共振 -簡介

由不配對電子的磁矩發源的一種磁共振技術,可用於從定性和定量方面檢測物質原子或分子中所含的不配對電子,並探索其周圍環境的結構特性。對自由基而言,軌道磁矩幾乎不起作用,總磁矩的絕大部分(99%以上)的貢獻來自電子自旋,所以電子順磁共振亦稱「電子自旋共振」(ESR)。

2 電子順磁共振 -基本原理

電子是具有一定質量和帶負電荷的一種基本粒子,它能進行兩種運動;一種是在圍繞原子核的軌道上運動,另一種是對通過其中心的軸所作的自旋。由於電子的運動產生力矩,在運動中產生電流和磁矩。在外加恆磁場H中,電子磁矩的作用如同細小的磁棒或磁針,由於電子的自旋量子數為1/2,故電子在外磁場中只有兩種取向:一與H平行,對應於低能級,能量為電子順磁共振;一與H逆平行,對應於高能級,能量為電子順磁共振,兩能極之間的能量差為電子順磁共振

若在垂直於H的方向,加上頻率為ν的電磁波使恰能滿足電子順磁共振這一條件時,低能級的電子即吸收電磁波能量而躍遷到高能級, 此即所謂 EPR現象。在上述產生EPR現象的基本條件中,h為普朗克常數,g為波譜分裂因子(簡稱g因子或g值),β為電子磁矩的自然單位,稱玻爾磁子。以自由電子的g值=2.00232,β=9.27410×10-21爾格/高斯,h=6.62620×10-27爾格·秒,代入上式,可得電磁波頻率與共振磁場之間的關係式:
     ν(兆赫)=2.8025H(高斯)

3 電子順磁共振 -檢測對象

主要檢測對象可分為兩大類:

① 在分子軌道中出現不配對電子 (或稱單電子)的物質。如自由基(含有一個單電子的分子)、雙基及多基(含有兩個及兩個以上單電子的分子)、三重態分子(在分子軌道中亦具有兩個單電子,但它們相距很近,彼此間有很強的磁的相互作用,與雙基不同)等。

② 在原子軌道中出現單電子的物質,如鹼金屬的原子、過渡金屬離子(包括鐵族、鈀族、鉑族離子,它們依次具有未充滿的3d,4d,5d殼層)、稀土金屬離子(具有未充滿的4f殼層)等。

4 電子順磁共振 -主要儀器

EPR波譜儀
電子順磁共振電子順磁共振

絕大多數儀器工作於微波區,通常採用固定微波頻率ν,而改變磁場強度H來達到共振條件。但實際上ν若太低,則所用波導管尺寸要加大,變得笨重,加工不便,成本貴;而ν又不能太高,否則H必須相應提高,這時電磁鐵中的導線匝數要加多,導線加粗,磁鐵要加大,亦使加工困難。常用的微波頻率有下列3種情況(見表)。其中尤以X波帶最為常用。

 波譜儀由4個部件組成:①微波發生與傳導系統;②諧振腔系統;③電磁鐵系統;④調製和檢測系統。

EPR波譜的主要特性

由於通常採用高頻調場以提高儀器靈敏度,記錄儀上記出的不是微波吸收曲線(由吸收係數X″對磁場強度H作圖)本身,而是它對H的一次微分曲線。後者的兩個極值對應於吸收曲線上斜率最大的兩點,而它與基線的交點對應於吸收曲線的頂點。

g值  從共振條件hν=電子順磁共振看來,hβ為常數,在微波頻率固定后,ν亦為常數,餘下的gH二者成反比關係,因此g足以表明共振磁場的位置。g值在本質上反映出一種物質分子內局部磁場的特徵,這種局部磁場主要來自軌道磁矩。自旋運動與軌道運動的偶合作用越強,則g值對ge(自由電子的g值)的增值越大,因此g值能提供分子結構的信息。對於只含C、H、N和O的自由基,g值非常接近ge,其增值只有千分之幾。

當單電子定域在硫原子時,g值為2.02-2.06。多數過渡金屬離子及其化合物的g值就遠離ge,原因就是它們原子中軌道磁矩的貢獻很大。例如在一種Fe3+絡合物中,g值高達9.7。

線寬  通常用一次微分曲線上兩極值之間的距離表示(以高斯為單位),稱「峰對峰寬度」,記作△Hpp。線寬可作為對電子自旋與其環境所起磁的相互作用的一種檢測,理論上的線寬應為無限小,但實際上由於多種原因它被大大的增寬了。

超精細結構  如在單電子附近存在具有磁性的原子核,通過二者自旋磁矩的相互作用,使單一的共振吸收譜線分裂成許多較狹的譜線,它們被稱為波譜的超精細結構。設n為磁性核的個數,I為它的核自旋量子數,原來的單峰波譜便分裂成(2nI+1)條譜線,相對強度服從於一定規律。在化學和生物學中最常見的磁性核為1H及14N,它們的I各為電子順磁共振及1。如有n1H原子存在,即得(n+1)條譜線,相對強度服從於(1+x)n中的二項式分配係數。如有n14N原子存在,即得(2n+1)條譜線,相對強度服從於(1+x+x2)n中的3項式分配係數。超精細結構對於自由基的鑒定具有重要價值。

吸收曲線下所包的面積  可從一次微分曲線進行兩次積分算出,與含已知數的單電子的標準樣品作比較,可測出試樣中單電子的含量,即自旋濃度。

5 電子順磁共振 -在生物學中的應用

研究生物組織中的自由基

在凍乾的動物組織和植物組織內均檢測出自由基,而在代謝過程活躍的組織(如綠葉、肝、腎)樣品內,自由基含量很高。又在蟻、果蠅、活鼠鼠尾、腐黑物、植物樹脂和各種動物與植物來源的黑素內均測知有自由基存在。

研究酶促反應中的自由基

直接證實了L.米夏埃利斯關於生物底物的氧化有階段性的假說(見生物氧化),已知有半醌型自由基作為中間產物生成,自由基濃度隨著電子轉移速率或酶活性而增大。在某些情況下,可利用超精細結構來鑒定自由基,並進而提供關於酶催化機理的信息和探測有關酶的活性部位的結構。

研究光合原初反應

證明在葉綠體、活的水藻和能進行光合作用的細菌中有光照所引起的自由基生成,它們全部參與光合電子傳遞鏈。這有助於闡明太陽能轉換成化學能的本質。

研究輻射原初過程

對於生物物質受高能輻射作用后所產生的自由基作定性與定量的檢測,已提供了輻射損傷程度及損傷部位的信息。還從較深入的研究得出涉及輻射效應的原初機理、氧效應、能量轉移、自旋轉移、生物物質的輻射敏感性、輻射防護和輻射敏化的許多極為重要的結果。

研究癌變過程中的自由基

已觀察到某些癌組織內的自由基含量低於正常組織。在用多種致癌物喂大鼠后,肝內可檢出一個特徵信號,在癌的診斷中可能有重要價值。還證明了由致癌物在組織中形成自由基的現象。

研究生物組織中的順磁金屬離子

研究生物組織中的順磁金屬離子(包括過渡族金屬 離子)對一些動物組織、植物材料和微生物都能見到銅(Ⅱ)、錳(Ⅱ)或鐵的EPR信號。已用EPR技術證實了一些含順磁性金屬的酶的活性與這些金屬的原子價態直接有關,這些金屬離子可能參與底物與酶的結合,例如黃嘌呤氧化酶中的鉬、琥珀酸脫氫酶中的鐵、血漿銅藍蛋白中的銅。

對血紅蛋白、肌紅蛋白及其數種衍生物的單晶,用EPR法測出的血紅素平面對外界晶軸的取向,比用別的方法所得結果更準確,且提供了有關分子中央鐵原子的化學鍵的信息,並證明血紅蛋白分子內4個血紅素平面並不相互平行。

許多鐵硫蛋白的發現,多半是由於EPR測定結果, 在其活性部位的鑒定和了解結構與功能的關係方面,EPR亦作出了主要貢獻。

自旋標記法

由美國的H.M.麥康奈爾於1965年首創,系指將一種穩定的自由基(最常用者為氮氧自由基)結合到單個分子或處於較複雜系統內的分子上的特定部位,而從 EPR波譜取得有關標記物環境的信息。在進行自旋標記時,應注意到盡量保持專一性和減少對天然系統的生物特性和分子特性引起的擾動。自旋標記物有 4個優點:①對溶劑的極性敏感,因此得以探究標記物周圍環境的疏水性或親水性;②對分子轉動速率極為敏感,因此能計測標記物的環境內所容許的活動程度,特別是計測由某種生化過程引起生物分子構象的改變;③EPR波譜較簡單,易於分析,由14N引起的三峰波譜能提供許多有價值的信息;④不存在來自抗磁性環境的干擾信號。

自旋標記物可通過共價鍵或通過象酶與輔酶、酶與底物、抗體與半抗原,以及膜與甾體的相互作用中所包含的那些非共價的引力被連接到目的物。自旋標記法現已被廣泛應用於研究生物高分子的構象、酶的活性部位的結構、脂質體和生物膜的結構及應用於免疫分析。

6 電子順磁共振 -參考書目.

向仁生:《順磁共振測量和應用的基本原理》,科學出版社,北京,1965。
裘祖文:《電子自旋共振波譜》,科學出版社,北京, 1980。
J.E.Wertz,J.R. Bolton,Electron S pin Resonance,Elementary Theory and Practical Applications,McGrawHill Book Co., New York,1972.
A. Pryor,Free Radicals in Biology,Vol. 1~6,Academic Press, New York,1976~1984.

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